HIV プロテアーゼ阻害薬の工業的製法 Viracept® (nelfinavir mesylate)

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1 HIV プロテアーゼ阻害薬の工業的製法 Viracept® (nelfinavir mesylate)
(3S,4aS,8aS)-N-tert-Butyl-2-[(2R,3R)-2-hydroxy-3-(3-hydroxy-2- methylbenzoylamino)-4-(phenylthio)butyl]decahydroisoquinoline- 3-carboxamide methanesulfonate salt 東北大学 農学部 化学工学概論（2009 年 12 月）

2 学んでほしいこと HIV ウイルスを例にしたウイルス生化学の初歩 危険な試薬や低温反応を回避するための努力
危険な試薬や低温反応を回避するための努力 　 多段階合成の工業化で鍵となるのは、中間体を簡便に単離（分離）する 方法（いつ・どのように）の確立 　 実用的な立体制御を実現するには、 〈急がば回れ〉の発想で 　 官能基の隠れた特性を引き出すには、 〈逆転〉の発想で

3 エイズ（AIDS） エイズ（AIDS）の正式名称は、後天性免疫不全 症候群（acquired immunodeficiency syndrome） ［AIDS は大文字で綴る］ 　 エイズは HIV ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス （human immunodeficiency virus）による感染で 引き起こされる［重複しても HIV ウイルスと言う］ 　 1978 年、最初の患者が米国で出現 　 1981 年、米国 CDC（Center for Disease Control）が 最初の症例を報告 　 2004 年末現在、世界で 3,940 万人が感染。 1 年間の死亡者は、310 万人（世界の死因の第 4 位）。 新しい感染者が毎年 490 万人（男 240 万人、女性 170 万人、子供 80 万人）発生 　 全患者の 7 割がアフリカ諸国に集まるが、最近では インド、タイ、ミャンマー、中国南部で急増

4 日本における HIV 感染の拡大

5 HIV 感染の臨床的特徴 性的接触、感染血液の注入（注射針の共用）による感染と母子垂直感染
感染後 1 週間以内に発熱、関節痛が起こり、異型リンパ球が出現（急性感染 症状） 　 3 週間から 3 ヶ月以内に HIV に対する抗体が陽性化 　 無症候の感染状態（潜伏期間）が 8–10 年も継続（1日 1010 個のウイルスが生成） 　 リンパ球（白血球）のうち、細胞膜表面に CD4 という タンパク質（細胞膜抗原）を持ったもの（T4 リンパ球）が じょじょに減少 　 全身のリンパ腺が腫れて発熱が起こり、体重が減少（AIDS 関連症候群） T4 リンパ球が減少した結果、免疫不全が引き起こされて 日和見感染症、カリニ肺炎、カポシ肉腫、腫瘍が発症。 CD4 を持った中枢神経細胞（グリア細胞）が減少すると 痴呆が発症 　 AIDS 発症後 5 年以内にほとんどの患者は死亡

6 HIV ウイルス HIV-1 と HIV-2 という 2 種のウイルスが存在
HIV の起源は、サル免疫不全ウイルス （ SIV: simian immunodeficiency virus）。 HIV-1 は、チンパンジーに感染する SIV から、 HIV-2 は、スーティマンガベイに感染する SIV からそれぞれ進化 　 もっとも古い HIV-1 は、1959 年に39歳の男性 から採取され、キンシャサ（ザイール共和国）の 病院に保管されていた血液から発見。 　AIDS 流行の起源は、1940 年代から1950 年代 初めに遡る 　 地球規模の AIDS 感染は HIV-1 によるもの。 HIV-2 の感染は西アフリカに限定 Chimpanzee (Pan troglodytes) Sooty mangabey (Cercocebus atys)

7 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2008
for his discovery of human papilloma viruses causing cervical cancer for their discovery of human immunodeficiency virus Harald zur Hausen (1936–) Françoise Barré-Sinoussi (1947–) Luc Montagnier (1932–) German Cancer Research Centre Heidelberg, Germany Regulation of Retroviral Infections Unit, Virology Department, Institut Pasteur Paris, France World Foundation for AIDS Research and Prevention Paris, France

8 HIV ウイルスの分離 1983 年、パスツール研究所のモンタニエ教授は、AIDS の前駆症状である リンパ腺腫（lymphadenopathy）を呈した患者からレトロウイルスを分離し、 リンパ腺病変ウイルス（LAV, lymphadenopathy-associated virus）と命名 　 1984 年 4 月、アメリカ国立ガン研究所の R. C. Gallo 教授は、AIDS の原因ウイルスを発見し、HTLV (human T lymphotrophic virus)-3 と命名 　 1984 年 8 月、カリフォルニア大学サンフランシスコ校の J. Levy 教授が第 3 のAIDS ウイルスとして、ARV (AIDS-related virus) を分離 　 仏（モンタニエ教授）と米（ギャロ教授）は特許の優先権を めぐっても対立。法廷闘争の過程で、モンタニエ教授が ギャロ教授とレヴィ教授に LAV を提供しており、遺伝子 解析の結果から HTLV-3 と ARV が LAV に由来することが判明 　 レーガン大統領とシラク首相のトップ会談で政治的に和解。特許は米・仏両 研究所の共有とし、ロイヤリティー収入の 80% で AIDS 研究と予防のための 基金（World Foundation for AIDS Research and Prevention ）を設立 Robert C. Gallo (1937–)

9 レトロウイルス HIV ウイルスは、レトロウイルス（retrovirus）の 1 種
レトロウイルスは、RNA ウイルスであるが、宿主細胞に侵入すると ゲノム情報を DNA にコピー（逆転写： reverse transcription） 　 レトロウイルスに由来する DNA は、宿主細胞の染色体に組み込まれてプロウイルス（provirus）化 　 プロウイルス化したまま、宿主細胞の RNA ポリメラーゼⅡの作用で、 ゲノム RNA を複製すると同時に、タンパク合成用の mRNA を転写 RT RT (+) RNA (-) DNA dsDNA Tat Nef Rev Env reverse transcription Vif Gag-Pol Vpu (RT = reverse transcriptase) integration Gag Vpr provirus translation mRNA splicing genome replication transcription

10 HIV ウイルスの中心部の構造 (+) RNA ゲノム（9.3 kb）のコピーが 2 本（diploid）［(+) RNA は mRNA に対応］ 　 1 本の RNA には、宿主細胞から奪った t-RNA （1 個）とタンパク質が会合 　 RNA に会合したタンパク質は、NC（nucleocapsid）タンパクと次の酵素 活性を持ったタンパク質： 　① reverse transcriptase (RT, RNA-dependent DNA polymerase) 　② integrase (IN)　　　　　 ③ protease (PR) 　④ ribonuclease (RH, RNase H) (+) RNA NC protein of enzyme activities RT, IN, PR, RH として機能 t-RNA 塩基配列が相補的な 部位で対を形成 kissing loop complex

11 HIV ウイルス粒子の構造 RNA とこれに会合したタンパク質は、CA（capsid）タンパク質で覆われ、 その上を MA（matrix）タンパク質がカバー 　 MA の外側は、宿主細胞から奪ったリン脂質 2 重膜（membrane）が被覆（enveloped ） 　 ウイルス粒子の外周には、宿主細胞を認識する突起（spike）が 14 本。 　その 1 本は、① TM (transmembrane glycoprotein/gp41) と ② SU （surface glycoprotein/gp120）の 3 量体（TM と SU は非共有結合で会合） membrane (envelope) MA spike SU (gp120) CA TM (gp41)

12 HIV ウイルスの構造 capsid 40–60 nm 20 nm 80–110 nm ・ 小文字は対応する遺伝子の名称
・ 小文字は対応する遺伝子の名称 ・ NC と t-RNA は描かれていない ・ spike は、TM と SU の（1:1）会合体がさらに 3 量化したもの 20 nm 80–110 nm

13 HIV ウイルスのゲノム MA CA p2 NC p1 p6 vif vpu tat nef gag R tat rev rev U3 R
5’ ① ② ③ gag R tat rev rev U3 R pol env 3’ U5 gp120 gp41 p6* PR RT RH IN vpr rev gag group specific antigen matrix, capsid, p2, nucleocapsid, p1, and p6 pol polymerase p6*, protease, reverse transcriptase, RNase H, integrase env envelope gp120 (SU), gp41 (TM) vif virion infective factor vpr viral protein R tat transactivator of transcription rev regulator of expression of virion proteins vpu viral protein U nef negative regulatory factor HIV-1 と HIV-2 で 異なるのはこの部分 R repeat sequence U unique sequence 調節遺伝子

14 HIV ウイルス粒子を構成する主要なタンパク質（1）
5’ gag pol env 3’ Gag-Pol (5%) Env MA CA NC PR RT RH IN SU (gp120) TM (gp41) Gag (95%) MA CA NC pol (polymerase) 酵素 env (envelope) 外皮タンパク質 gag (group-specific antigen) 内部構造タンパク質 trans- membrane (gp41) TM PR (protease) RT (reverse transcriptase) RH (RNase H) IN (integrase) pol Env env Pol surface protein (gp120) SU NC (nucleocapsid) CA (capsid) MA (matrix) gag Gag membrane (envelope)

15 HIV ウイルス粒子を構成する主要なタンパク質（2）
5’ gag pol env 3’ Gag-Pol (5%) Env MA CA NC PR RT RH IN SU (gp120) TM (gp41) Gag (95%) MA CA NC 粗面小胞体で Env が合成 ゴルジ体でグルコシル化と 切断が起こって SU とTMに を生成 細胞質で Gag-Pol と Gag がポリプロテイン として合成 　 RNA と会合してリン脂質 2 重膜で囲われると Gag-Pol が自己開裂 　 PR が Gag と残ったGag-Pol を切断して MA、CA、NC、PR、RT、RH、IN を生成 （ウイルス粒子の成熟化） SU (surface) TM (trans-membrane) envelope proteins env PR (protease) RT (reverse transcriptase) RH (RNase H) IN (integrase) MA (matrix) CA (capsid) NC (nucleocapsid) Internal structural proteins enzymes pol gag

16 HIV ウイルスの増殖サイクル 1. 宿主細胞への吸着と侵入 ① 2. ゲノム RNA の DNA への逆転写 ②
1. 宿主細胞への吸着と侵入 ① 2. ゲノム RNA の DNA への逆転写　② 　 3. プロウイルス（dsDNA）の宿主染色体 への挿入 　 4. プロウイルス DNA を鋳型とした ゲノム RNA の複製と mRNA の転写 　 複数のタンパク質が一つのポリ ペプチド鎖として繋がったポリ プロテインの合成 　 　 6. ポリプロテイン、ゲノム RNA、t-RNA の集合　③ 　 核酸（RNA）‐ポリプロテイン会合体の細胞膜による被覆と出芽 　 ポリプロテインの加水分解によるウイルス粒子の成熟 　 9. ウイルス粒子の放出 ④

17 HIV ウイルスの吸着 HIV ウイルスは、スパイク先端のSU （surface glycoprotein/gp120）で宿主細胞を認識［gp120 = 質量 120 kD の glycoprotein（糖タンパク質）］ ヒトで SU の受容体（receptor）になるのは、細胞表層に存在するタンパク質である CD4 （CD = cluster of differentiation）。 　CD4 は、免疫系細胞（T 細胞、マクロファージ、単球）や脳細胞（グリア細胞）に分布 SU はさらに、ケモカイン（chemokine）受容体である CCR5 と CXCR4 を共受容体 （co-receptor）として利用（C = cystein, X = any amino acid, R = receptor）。　 HIV-1 strain Co-receptors CD4 T cells infected CCR5 CXCR4 naïve cells memory cells R5 + – R5X4 X4 R5 株と R5X4 株は、 CCR5 を発現したマクロファージ、単球にも感染

18 HIV ウイルスの核への移動 MA Vpr SU （gp120）が受容体（CD4）と共受容体 （CCR，CXCR4）と結合すると、TM （transmembrane glycoprotein/gp41）の 立体構造が変化し、ウイルスの リン脂質 2 重膜（envelope）と細胞膜 （plasma membrane）が融合 　 細胞質内に放出されたウイルス粒子の 内容物は、reverse transcription complex を形成 　 reverse transcription complex は、 微小管（microtuble）を伝って核に移動 （1–4 mm/sec） 　 reverse transcription complex の中で ゲノム RNA から dsDNA が合成され、 pre-integration complex を形成 (+)-RNA microtuble t-RNA RT IN reverse transcription complex dsDNA pre-integration complex nucleus

19 pre-integration complex
プロウイルス化 dsDNA reverse transcription complex は、 核孔（nuclear pore）を通って核内に侵入 　 reverse transcription complex を構成する 　　① MA（matrix） 　　② Vpr（viral protein R） 　　③ IN（integrase） には核局在化シグナル （nuclear localization signal）が存在 　 IN が染色体のDNA に ウイルス由来の dsDNA を 挿入 Vpr pre-integration complex nucleus nuclear pore 3000– 5000 pores per nucleus integrase (IN) provirus cell chromosome

20 HIV ウイルス遺伝子の複製と転写・翻訳 プロウイルスのまま、宿主細胞の RNA ポリメラーゼ（cell pol II）がゲノム RNA の 複製と mRNA の転写を触媒 　 増殖初期に翻訳されるのは、① 複製を刺激する Nef 、② 転写を強化する Tat、 ③ mRNA を核外に運ぶ Rev 　 増殖後期に翻訳されるのは、複数のタンパク質が 1 本に繋がったポリプロテイン （Gag，Gag-Pol，Env） 　 Gag と Gag-Pol は細胞質で合成 Env の合成とグリコシル化は粗面小胞体で起こり、3 量化したのちゴルジ体の中で 宿主のプロテアーゼ（furin）で SU（gp120） と TM（gp41）に切断 plasma membrane rough endoplasmic reticulum provirus Golgi TM Env SU host protease cell pol II Gag-Pol Gag genome RNA mRNA

21 HIV ウイルスの成熟化 RNA + NC (nucleocapsid) ポリプロテイン（Gag，Gag-pol）、ゲノム RNA、t-RNA が細胞 膜直下に集合し、SU (gp120)-TM (gp41) の埋め込まれた膜を 奪って出芽 　 Gag-Pol が 2 量化すると、自己開裂して酵素タンパク質（PR, RT, RH, IN）を放出 　 PR（protease）が Gag を加水分解し、ウイルス粒子を成熟化 CA (capsid) MA (matrix) Golgi MA CA NC SU TM RNA TM SU MA CA NC t-RNA Gag Gag Gag-pol PR RT, RH, IN myristyl [CH3(CH2)12CO] plasma membrane Gag-pol Gag-pol

22 抗 HIV ウイルス薬 HIV ウイルスの CD4 (+) 細胞への感染（吸着・侵入）を阻止

23 HIV ウイルスの侵入阻害薬 Enfuvirtide（fuzeon®）は、HIV ウイルスの CD4 受容体との結合を阻害
Ac-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser- Gln-Asn-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu- Glu-Leu-Asp-Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Trp-Asn-Trp-Phe-NH2 Acetyl-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-amide Enfuvirtide（fuzeon®）は、HIV ウイルスの CD4 受容体との結合を阻害 　 Enfuvirtide は、直鎖状のペプチド （32 個のアミノ酸残基で構成） 　 2003 年、米国で承認されたが、 適用は従来の抗 HIV 薬が無効の AIDS 治療（年間の薬剤費は US$ 25,000）

24 HIV ウイルスに固有の生化学プロセス (+)-RNA dsDNA (-) DNA pre-integration complex
RT (reverse transcriptase) reverse transcription complex IN (integrase) provirus cell chromosome Gag-pol Gag-pol gag-pol PR (protease) RT, RH, IN, AIDS 治療薬として 開発に成功した化合物 　 RT 阻害剤（RTI） PR 阻害剤（PI） MA (matrix) CA (capsid) NC (nuclear capsid) gag Gag

25 逆転写酵素阻害剤（RTI）  逆転写酵素（RT; reverse transcriptase）は、ヒトの細胞には存在しない
RT の選択的阻害剤（RTI; reverse transcriptase inhibitor）は、HIV ウイルスに 対する高い選択毒性を可能にする 　 RTI は、 AIDS 患者の中で HIV ウイルスに感染した細胞が増加することを抑制。 　しかし、 HIV ウイルスのゲノムが染色体に組み込まれた（プロウイルス化した）、 感染細胞が新たな HIV ウイルス粒子を生みだすこと（増殖そのもの）は抑制できない 　 2 種類の RTI が存在 ① ヌクレオシド系（NRTI; nucleoside reverse transcriptase inhibitor ） ② 非ヌクレオシド系（NNRTI; non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor ） (+) RNA (-) DNA  RTI dsDNA NRTI (AZT) NNRTI (NVP)

26 ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（NRTI）
② 3 リン酸化された NRTI は、ウイルス RT が基質として認識し、 ウイルス (+)-RNA を鋳型として伸長中の (-)-DNA 鎖に組み込む 　 ③ NRTI には糖部 3’ 水酸基がないため、(-)-DNA 鎖の合成が中断する AZT 5’ + - ①  ② 3’ ③ RT AZT triphosphate (AZT-5-P3) + - + -

27 臨床で使用されている NRTI ジドプシン （AZT） サルニブシン（d4T） ジダノシン（ddl） ザルシタビン（ddC）
+ ザルシタビン（ddC） - AZT-5-P3 は、細胞の DNA ポリメラーゼよりも HIV ウイルスのRT に強く結合 HIV ウイルスのRT は、dT-5-P3 よりも AZT-5-P3 と強く結合 AZT（AZT-5-P3）は細胞の DNA 合成に無影響ではなく、副作用として骨髄を傷害 ラミブジン（3TC） テノフォビル（PMPA） 糖部は L-配置で 非天然型 アバカビル（ABC）

28 非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（NNRTI）
NNRTI は、HIV ウイルスの RT の活性部位とは異なる部位に結合し、 酵素の立体構造を変化させることによって逆転写活性を低下させる 　 NNRTI は、 NRTI と比べて薬剤耐性 HIV ウイルス変異株が出現しやすい 　 一つの NNRTI に耐性の変異ウイルスは、他の NNRTI にも交叉耐性（cross- resistance）を示しやすい 　　 3 種類の NNRTI が臨床で使用されている エファビレンツ （EFV） ネビラビン （NVP） デラビルジン（DLV）

29 プロテアーゼ阻害剤（PI） HIV ウイルスの プロテアーゼ（PR）は、ポリプロテインの Gag を加水分解して MA（matrix）、CA（capsid）、NC（nuclear capsid）を生成 　 プロテアーゼ阻害剤（PI; protease inhibitor）は、 Gag から MA、CA、NC が 作られるのを妨げ、ウイルス粒子の成熟を阻止 　 プロウイルスから新しい HIV ウイルスが生まれること（増殖そのもの）を阻害 2 量化 自己開裂 Gag-pol myristyl Gag PI PR (protease)  MA CA NC RT (reverse transcriptase) RH (RNase H) IN (integrase) ウイルス粒子 の内部構造の 形成に不可欠

30 プロテアーゼ阻害剤（PI） HIV ウイルスの プロテアーゼ（PR）は、同一構造のサブユニットが二つ会合した ホモダイマー。一つのサブユニットは、99 個のアミノ酸残基で構成 　 PR はアスパラギン酸プロテアーゼ。活性部位に特徴的な配列は、Asp25–Thre26–Gly27 　 HIV プロウイルスから翻訳されたポリプロテイン（Gag）の Phe–Pro 結合を選択的に 切断 Asp 25 Asp 25’ - Ile 50 Ile 50’

31 加水分解の遷移状態をまねた PI のデザイン
サキナビル（SQB） 1995 年に承認された 世界で最初の PI

32 臨床で使用されている PI ネルフィナビル（NFV） インジナビル（IDV） リトナビル（RTV） アタザナビル（ATV）
アンプレナビル（APV）

33 AIDS（HIV 感染症）に対する薬物療法
RTI（逆転写酵素阻害剤） ヌクレオシド系（NRTI） AZT, ddl, ddC, 3T, d4T, ABC, PMPA 非ヌクレオシド系（NNRTI） NVP, EFV, DLV 　 PI（プロテアーゼ阻害剤） IDV, SQV, RTV, NFV, APV, ATV 　 HAART（highly active antiretroviral therapy） RTI （2 剤、最近では NRTI と NNRTI 各 1 剤）と PI （1 剤）を併用 HAART によっても、潜伏感染細胞がなくなることはなく、HIV ウイルスの低レベルの増殖はつねに持続 　 現在使用されている薬剤の抱える課題 　　① 長期投与による毒性 　　② 薬物相互作用 　　③ 耐性変異株の出現

34 Nelfinavir（NFV）の製法開発
創薬研究をベースにした初期合成ルート コア中間体（遷移状態 アナログ部分）の合成 研究 究極（？）の製造ルート P2 P1 P1’ Asn Phe Pro HIV virus PR

35 Nelfinavir の創薬ルート（初期製法）
Cbz Reich, S. H.; et al. J. Med. Chem. 1997, 40, 3979.

36 3-Hydroxy-2-methylbenzoic acid の合成

37 3-Hydroxy-2-methylbenzoic acid
HSO4 + 0.3 M aq NaNO2 (1.0 equiv) < 5 C, 1 h 1 M aq H2SO4 (1.9 equiv) 65 C (bath temp) 1.5 h 57 C (inner temp) 1 h - + HSO4 Inaba, T.; et al. J. Org. Chem. 1998, 63, 7582.

38 アニリンのジアゾ化 + + + + + + + + Na H2SO4 NaHSO4 H H2O (H2SO4) H H H2O + - +

39 ジアゾニウム塩の加水分解 H2SO4 H2SO4 + - HSO4 HNO2 NaNO2 + - HSO4 - HSO4 + N2 H2O

40 (3S,4aS,8aS)-N-tert-Butyl- dcahydroisoquinoline-2-carboxamide

41 L-Phe に対する Pictet-Spengler 反応
(3S)-tetrahydroisoquinoline- 3-carboxylic acid CH2O aq HCl (high concentration) NH4OH L-phenylalanine (Phe) (little racemization) crystallization of free amino acid + + H optically pure material (70%) Hilpert, H.; et al. Chimia. 1996, 50, 532.

42 アミノ基を保護すると同時にカルボキシル基を活性化
1. 2. (80%) N-carboxyanhydride Hilpert, H.; et al. Chimia. 1996, 50, 532.

43 ベンゼン核の高温・高圧接触還元 H2 Ru/Alox AcOEt 100–150 bar 100–150 C (80–85%) H H
up to 94% selectivity Ru N-tert-Butyl-(3S,4aS,8aS)- decahydroisoquinoline-3-carboxamide Hilpert, H.; et al. Chimia. 1996, 50, 532.

44 (2S,3R)-3-N-Benzyloxycarbonyl- amino-4-phenylthio-1-buteneoxide
Cbz

45 Nelfinavir のコア中間体の逆合成
Cbz = Nu N-Cbz L-Serine Reich, S. H.; et al. J. Med. Chem. 1997, 40, 3979.

46 (R)-N-Cbz-b-(Phenylthio)alanine
Cbz = CO2CH2Ph MeO2CN= (DMAD) 2 (1.0 equiv) N-Cbz L-Ser (100 g) CH2Cl2 THF 15 min 20 min Ph3P (1.0 equiv) CH2Cl2 -55 C 30 min -55 C  rt overnight CH2Cl2/THF NaH (60% in oil) (1.0 equiv) 20 min - + Na THF rt rt 2.5 h (1.0 equiv) 15 min (54 g, 39%) Reich, S. H.; et al. J. Med. Chem. 1997, 40, 3979.

47 分子内 Mitsunobu（光延）反応 DMAD + - Ph3P - + + -

48 b-ラクトンに対する求核的開裂反応 Na Na pH 2.5 AcOEt H2O H2O CH2Cl2 AcOEt
+ Na - + Na pH 2.5 AcOEt H2O H2O CH2Cl2 AcOEt 1 M aq NaHSO4 ［酸性画分］ (39%) ［中性画分］

49 ジアゾケトンを経由する a-クロロケトンの調製
(1.5 equiv) Et3N (1.0 equiv) AcOEt dry ice-CCl4 cooling Cbz = CO2CH2Ph dry ice-CCl4 cooling, 30 min + - Et2O (3.9 equiv) rt, 40 min HCl (gas) + Et2O -20 C, 4 h - (73% after flash chromatog) Reich, S. H.; et al. J. Med. Chem. 1997, 40, 3979.

50 ジアゾメタン（diazomethene）の調製
KOH で乾燥後 CH2N2 の Et2O 溶液として使用 + - + - Et2O H2O - + 5 M aq NaOH (5.1 equiv) HO Na + - Na OH - - 1-methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidine Reich, S. H.; et al. J. Med. Chem. 1997, 40, 3979.

51 ジアゾメタンを発生させるための試薬 N-methyl-N-nitroso-p-toluenesulfonamide
+ - + - - - N-methyl-N-nitrosourea 1-methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidine

52 Reich, S. H.; et al. J. Med. Chem. 1997, 40, 3979.
混合酸無水物とジアゾケトンとの反応 + - + - R Cbz = CO2CH2Ph dry ice-CCl4 cooling (30 min)  rt (40 min) - - + + - + - + (73% after flash chromatog) Reich, S. H.; et al. J. Med. Chem. 1997, 40, 3979.

53 Reich, S. H.; et al. J. Med. Chem. 1997, 40, 3979.
ジアゾケトンと塩化水素の反応 + - H Cl - Cl HCl (gas) + + - Et2O -20 C, 4 h Cbz = CO2CH2Ph (white solid) Reich, S. H.; et al. J. Med. Chem. 1997, 40, 3979.

54 Reich, S. H.; et al. J. Med. Chem. 1997, 40, 3979.
NaBH4 (1.1 equiv) THF, ice-cooling flash chromatog (1) 0–2% MeOH in CH2Cl2 (2) 0–2% AcOEt in CHCl3 slower moving, major fraction (39% from diazoketone) Reich, S. H.; et al. J. Med. Chem. 1997, 40, 3979.

55 1,2-不斉誘起のメカニズム NaBH4 (1.1 equiv) THF, ice-cooling Cbz = CO2CH2Ph H
Felkin-Anh モデル

56 クロロヒドリンのエポキシドへの変換（立体保持）
KOH (1.1 equiv) 2 h ice-cooling rt EtOH flash chromatog (0–2% MeOH in CH2Cl2) (white solid, 85%) Reich, S. H.; et al. J. Med. Chem. 1997, 40, 3979.

57 Reich, S. H.; et al. J. Med. Chem. 1997, 40, 3979.
エポキシドに対する求核置換反応 Cbz = CO2CH2Ph reflux flash chromatog (0–20% AcOEt in CH2Cl2) EtOH 8 h (1.1 equiv) (white solid, 40%) Reich, S. H.; et al. J. Med. Chem. 1997, 40, 3979.

58 Reich, S. H.; et al. J. Med. Chem. 1997, 40, 3979.
第 1 級アミンの脱保護 = Cbz (white foam, 71%) flash chromatog [CHCl3 (3 drops of conc NH4OH/L) with 0–10% MeOH] 30% HBr/AcOH (40 v/w) rt, 1 h concentration azeotroping with PhMe ( 3) Et2NH (2 v/w) conc NH4OH (2 v/w) MeOH (30 v/w) concentration extractive work-up Reich, S. H.; et al. J. Med. Chem. 1997, 40, 3979.

59 Cbz 基の除去 R Br 30% HBr/AcOH H S が触媒毒となるので Cbz の除去に接触還元が使えない H HX X
- Br 30% HBr/AcOH + H S が触媒毒となるので Cbz の除去に接触還元が使えない + H - HX - X (X = Br, OAc) Reich, S. H.; et al. J. Med. Chem. 1997, 40, 3979.

60 Radial chromatog (1 mm plate)
Nelfinavir の完成 • H2O (1.0 equiv) (1.0 equiv) THF -10 C (1.0 equiv) -10 C  rt (overnight) rt, 48 h in total Radial chromatog (1 mm plate) 3% MeOH in CH2Cl2) Reich, S. H.; et al. J. Med. Chem. 1997, 40, 3979. (white foam, 59%)

61 活性エステルを経由するアミドの形成 活性エステル 1-hydroxybenzotriazole (HOBt)
1,3-dicyclohexylcarodiimide (DCC) 活性エステル

62 Nelfinavir mesylate (Viracept®)
MeSO3H (1.0 equiv) (1.0 M in CH2Cl2) CH2Cl2 0 C salt precipitated (99%) • Reich, S. H.; et al. J. Med. Chem. 1997, 40, 3979.

63 Reich, S. H.; et al. J. Med. Chem. 1997, 40, 3979.
コア中間体の創薬ルートにおける課題 光延反応 　 高価な試薬 （MeO2CN=NCO2Me, Ph3P） 　 低温反応（b-ラクトンの形成） 1,2-不斉誘起 （ a-アミノケトンの立体選択的還元） 　 ジアステレオマーの副生 N-Cbz L-Serine Cbz = CO2CH2Ph 増単反応（a-クロロケトン合成） 　 危険なジアゾメタン（CH2N2）の使用 　 低温反応 Reich, S. H.; et al. J. Med. Chem. 1997, 40, 3979.

64 煩雑さ（増炭反応）も曖昧さ（不斉誘起）もないルート
- Cl Terminal differentiation Reduction - PhS Regioselective epoxide opening Oxidative cleavage H3N + - Na Ikunaka, M.; et al. Org. Process Res. Dev. 2002, 6, 49.

65 D-Erythronolactone の調製
30% aq H2O2 Na2CO3 - Na + - Na + Sodium erythorbate conc HCl D-Erythronolactone (89%) Dunigan, J.; Weigel, L. O. J. Org. Chem. 1991, 56, 6225.

66 エンジオールの酸化的開裂 Na + - - HO - Na + - - HO + - Na - - - - Na + - HO

67 Dunigan, J.; Weigel, L. O. J. Org. Chem. 1991, 56, 6225.
conc HCl - Na + HCl H2O 酸性にすると室温で脱水・閉環 NaCl + H + H Dunigan, J.; Weigel, L. O. J. Org. Chem. 1991, 56, 6225.

68 Methyl (2S,3R)-4-hydroxy-2,3-epoxybutyrate
Ts –15–0 C (93%) NaOMe, MeOH + –10–0 C - (94%) Cl Dunigan, J.; Weigel, L. O. J. Org. Chem. 1991, 56, 6225.

69 Dunigan, J.; Weigel, L. O. J. Org. Chem. 1991, 56, 6225.
Ts NaOMe MeOH –10–0 C - + Na - MeO + Na + - - + Na Na (94%) Dunigan, J.; Weigel, L. O. J. Org. Chem. 1991, 56, 6225.

70 エポキシドの位置選択的開環によるアミノ基の導入
NaOH (1.1 equiv)/MeOH 6 h overnight MeOH ice-cooling –12 C エステルのままアンモニアで処理するとアミドが副生する 沈殿 conc aq NH3 48–50 C, 10 h - + Na - + Na H3N カルボニル基で活性化されたエポキシ炭素で位置選択的に開環 Manchand, P. S.; et al. J. Org. Chem. 1988, 53, 5507.

71 アミノ基の保護（Cbz 化） ≡ 未反応 NH3 aq NaHCO3 (0.7 equiv) Na 減圧濃縮 Na Ice-cooling
+ Na ≡ + 減圧濃縮 - Na Ikunaka, M.; et al. Org. Process Res. Dev. 2002, 6, 49. Ice-cooling 5–10 C 5 h Cbz-Cl (1.0 equiv) - + Na

72 Ikunaka, M.; et al. Org. Process Res. Dev. 2002, 6, 49.
再ラクトン化と生成物の単離 Cbz 洗浄 [(1) i-Pr2O  2. (2) PhMe-AcOEt (1:1)  3.] pH 3 - + Na 2 M aq HCl • H2O rt (0.5 equiv) rt overnight AcOEt （抽出） mp126–129 C 63% (4 steps) Ikunaka, M.; et al. Org. Process Res. Dev. 2002, 6, 49.

73 ラクトンの還元と水酸基の区別 ≡ CaCl2 (2.0 equiv) NaBH4 (4.0 equiv) MeOH MeOH
Ca(BH4)2 < 30 C NaCl rt 4 h HCl (10% in MeOH) pH 2 - + （定量的） PPTS (72%) ≡ mp 126–129 C Ikunaka, M.; et al. Org. Process Res. Dev. 2002, 6, 49.

74 PPTS (pyridinium p-toluenesulfonate)
1,2-ジオールの選択的アセタール化 Cbz = CO2CH2Ph 2 H2O H2O - + PPTS (pyridinium p-toluenesulfonate) 強酸と弱塩基の塩なので弱酸性

75 アセタール化（acetonide 形成）のメカニズム
+ + H + + + + H2O + +

76 フェニルチオ基の導入 MeSO2Cl (1.2 equiv) Et3N (1.5 equiv) PhMe rt, 2 h
Cbz = CO2CH2Ph 孤立した第 1 級水酸基が 1,2-ジオールから区別 K2CO3 (2.0 equiv) DMF rt, 4 h (1.0 equiv) Et3N (79%) + - Et3NH Cl mp 115–118 C

77 1.2-ジオールの脱保護（アセタールの除去） ≡ 0.1 M aq HCl 80 C MeOH 1.5 h mp 126–129 C
+ H ≡ 0.1 M aq HCl MeOH 80 C 1.5 h + + + mp 126–129 C (79%) (R = H, Me)

78 1,2-ジオールの活性化とクロロ基の位置選択的導入
Li + + - Li Cl LiCl (3.9 equiv) DMF 80 C, 1.5 h (2.6 equiv) Et2N (3.9 equiv) CHCl3 ice cooling  rt rt, 10 min Ikunaka, M.; et al. Org. Process Res. Dev. 2002, 6, 49. Lohray, B. B. Synthesis 1992, 10.

79 (2S,3R)-3-(N-Benzyloxycarbonyl)- amino-1-chloro-4-phenylthiobutan-2-ol
Li + mp 113–114 C (70%) 2.0 M aq HCl rt AcOEt（抽出） 褐色固体 再結晶（AcOEt/n-hexane） 活性炭 Ikunaka, M.; et al. Org. Process Res. Dev. 2002, 6, 49.

80 (2S,3R)-4-hydroxy-2,3-epoxybutyrate ルートのまとめ
+ Na + - - Na Cl H3N アミノ基の立体選択的導入に C4 分子両端の酸化段階の違いを利用 1,2-ジオールを孤立した第 1 級水酸基から区別 全工程を通じてクロマトグラフィー精製が不要 通算収率 17% （14 工程） - PhS Ikunaka, M.; et al. Org. Process Res. Dev. 2002, 6, 49.

81 (2S,3R)-2-amino-1,3,4-butanetriol (ABT)
SN2 反応によるアミノ基の導入 1 4 3 (2S,3S) 1 meso 4 2 3 位水酸基の立体反転 (2S,3R)

82 4,4-Dimethyl-3,5,8-trioxabicyclo[5.1.0]octane
30% H2O2 (1.1 equiv) reflux, 2 h 20 mM Na2HPO4 (2.5  10-3 equiv) MeOH, MeCN pH 8.0–9.6 (1 M NaOH) 60–72 C, 1 h bp 144–146 C (89%) (2.1 equiv) • H2O (85%) ① ② (0.004 mol%) • bp 63–65 C MeOH 3 5 • bp 78–85 C 8 1. Elliot, W. J.; Fried, J. J. Org. Chem. 1976, 41, 2469. 2. Inaba, T.; et al. J. Org. Chem. 1998, 63, 7582.

83 (R)-a-MBA による meso-エポキシドの開環
 (R)-a-MBA (1.0 equiv) (b) i-PrOH, reflux, 24 h (a) (b) 1 6 (1:1)  5 3 Inaba, T.; et al. J. Org. Chem. 1998, 63, 7582.

84 trans-アミノアルコールのジアステレオマーの分離
3 1 + 6 5 (1:1) (5R,6S) (5S,6R) n-heptane i-PrOH 溶液 1 3 39% > 99% de 6 5 n-heptane/i-PrOH (6:1) 5 C, 3 h 結晶 (5R,6S)/(5S,6R) > 99.5:0.5 Inaba, T.; et al. J. Org. Chem. 1998, 63, 7582. mp 108–109 C

85 熱力学的に安定な 5 員環アセタールへの転移 (0.1 equiv) MeSO3H (1.25 equiv) MeCOMe
< 25 C, 4 h 1) H2 (5 kg/cm2) 5% Pd/C (50% wet type, 10% w/w) - (1.0 equiv), i-PrOH 60 C, 9 h + mp 112–113 C 2) n-heptane/i-PrOH (9:1) から結晶化 55–60 C  0–5 C (1 h) ［82%（2 工程）］ Inaba, T.; et al. J. Org. Chem. 1998, 63, 7582.

86 アミノ基の保護（Cbz） PhCH2OCOCl (Cbz-Cl, 1.0 equiv) K2CO3 (1.25 equiv)
PhMe/H2O (1:1) rt, 3 h - + Cbz Inaba, T.; et al. J. Org. Chem. 1998, 63, 7582.

87 水酸基のスルフィドへの変換（one-pot）
MeSO2Cl (MsCl, 1.1 equiv) Et3N (1.2 equiv) PhMe < 10 C, 1.5 h (Cbz = PhCH2OCO) (Ms = SO2Me) (1.2 equiv) NaOH (1.2 equiv) n-Bu4NBr (2 mol%) PhMe, 55 C, 2.5 h Inaba, T.; et al. J. Org. Chem. 1998, 63, 7582.

88 1,2-ジオールのアセタール保護基の除去 conc HCl (5 mol%) MeOH, H2O reflux, 3.5 h
第 2 級水酸基の立体反転 - + ammonium benzoate からの 4 反応通算収率 > 95% (HPLC) Inaba, T.; et al. J. Org. Chem. 1998, 63, 7582.

89 第 2 級水酸基のメシル化（one-pot） PNB-Cl (1.2 equiv) AcOEt 2-picoline 5–10 C
8.5 h MeSO2Cl (MsCl, 1.2 equiv) Et3N (2.4 equiv) AcOEt < 15 C, 0.5 h 再結晶［AcOEt/heptane (1:3)］ mp 117–118 C (PNB = p-nitrobenzoyl) （ammonium benzoate からの 6 反応通算収率　84%） Inaba, T.; et al. J. Org. Chem. 1998, 63, 7582.

90 立体反転を伴なうエポキシドの形成 PNB 2 M aq KOH (2.2 equiv) 1,4-dioxane rt, 1 h Cbz
Column chromatog Ms mp 61–62 C (Et2O/n-hexane) Inaba, T.; et al. J. Org. Chem. 1998, 63, 7582. (98%)

91 エポキシドの開環と Cbz 基の除去 (1.1 equiv) (40%) EtOH, reflux, 8 h flash chromatog
[0–20% AcOEt in CH2Cl2] (Cbz = CO2CH2Ph) 30% HBr/AcOH rt, 1 h Reich, S. H.; et al. J. Med. Chem. 1997, 40, 3979. flash chromatog 0–10% MeOH in CHCl3 (3 drops of NH4OH/1 L) (71%)

92 メシラートとアミンの直接的反応 K2CO3 (2.1 equiv) 67% aq MeOH (9 v/w) 60–55 C rt
H2O (3 v/w) (1.0 equiv) Centrifugation 33% aq MeOH (3 v/w) H2O (3 v/w) 立体反転した エポキシドを経由 (86%) Inaba, T.; et al. J. Org. Chem. 2000, 65, 3979.

93 Radial chromatog (1 mm plate)
Nelfinavir の完成 • H2O (1.0 equiv) (1.0 equiv) THF (1.0 equiv) -10 C  rt (overnight) rt, 48 h in total Radial chromatog (1 mm plate) 3% MeOH in CH2Cl2 Reich, S. H.; et al. J. Med. Chem. 1997, 40, 3979. (white foam, 59%)

94 Nelfinavir mesylate (Viracept®)
MeSO3H (1.0 equiv) (1.0 M in CH2Cl2) CH2Cl2 0 C salt precipitated (99%) • Reich, S. H.; et al. J. Med. Chem. 1997, 40, 3979.

95 Nelfinavir の製法の全体最適化 (2S,3R)-2-amino-1,3,4-butanetriol (ABT) の不斉合成
官能基変換の効率化 ABT の両端の第 1 級水酸基の区別 第 2 級水酸基の立体反転 4 1 (2S,3S)  3 2 (2S,3R)

96 Catalytic asymmetric aminolysis
H2O (10 mol%) heptane-PhMe (9:1) (1.0 equiv) 40 C (24 h) 95% conv (HPLC) 97% ee + Ti(Oi-Pr)4 (1:1) (0.5 mol%) Ti (S)-1,1’-bi-2-naphthol Enantiomeric discrimination between two acetal oxygen atoms by the (S)-1,1’-bi-2-naphthol-titanium complex Inaba, T.; et al. J. Org. Chem. 1999, 64, 4962.

97 (5R,6S)-2,2-Dimethyl-6-amino-1,3-dioxepan-5-ol
(1.0 equiv) rt, 10 min heptane-PhMe (9:1) 40 C 24 h Ti(Oi-Pr)4 (0.5 mol%) H2O (10 mol%) PhMe (2.9 v/w) (0.5 mol%) 1 M aq NaOH (0.15 equiv) reflux, 1 h 99% ee (84%) activated charcoal (1% w/w) 1 h H2 (3 atm) 5% Pd/C (55% wet type) (0.19 w/w) AcOH (1.0 equiv) H2O (0.34 v/w) - + AcO i-PrOH/heptane (1:1.7, v/v) i-PrOH (11 v/w) rt, 24 h heptane Inaba, T.; et al. J. Org. Chem. 1999, 64, 4962.

98 ABT の両端の第1級水酸基の区別 Inaba, T.; et al. J. Org. Chem. 1999, 64, 4962.

99 3-Acetoxy-2-methylbenzoyl chloride
M aq NaNO2 (1.0 equiv) 1 M aq H2SO4 (1.9 equiv) < 5 C, 1 h 2. 65 C (bath temp), 1.5 h 3. 57 C (inner temp), 1 h (Ac2O) SOCl2 (1.1 equiv) HCONMe2 (DMF, 6 mol%) (2.1 equiv) pyridine (5.0 equiv) rt, 3.5 h PhMe 60 C, 2.5 h (72%) Inaba, T.; et al. J. Org. Chem. 1999, 64, 4962.

100 N,N-dimethylformamide
酸塩化物を調製する際の DMF の触媒効果 N,N-dimethylformamide (DMF) + - thionyl chloride Cl Vilsmeier 試薬 DMF + + - Cl

101 N-アシル化と O-メシル化 (1.0 equiv) AcO NaHCO3 (2.5 equiv) CH2Cl2, H2O, rt, 2 h
+ CH2Cl2, H2O, rt, 2 h MeSO2Cl (1.2 equiv) Et3N (1.5 equiv) CH2Cl2 10 C, 40 min Inaba, T.; et al. J. Org. Chem. 1999, 64, 4962.

102 オキサゾリン環の形成（H2Oでクエンチ） NMM (1.2 M in H2O, 0.4 equiv) BF3•OEt2
< 15 C CH2Cl2 30 C, 23 h EtOH/n-hexane (1:1) BF3•OEt2 mp 102–103 C - Et2O + 不安定 (51%) Inaba, T.; et al. J. Org. Chem. 1999, 64, 4962.

103 オキサゾリン環の形成（Ac2O でクエンチ）
NMM (2.1 M in H2O, 1.5 equiv) BF3•OEt2 (3.0 equiv) Ac2O (1.2 equiv) CH2Cl2 30 C, 23 h 10 C 30 min < 15 C Inaba, T.; et al. J. Org. Chem. 1999, 64, 4962.

104 第 2 級水酸基の反転 K2CO3 (3.0 equiv) MeOH/H2O (1:1) 50 C 5.5 h H2O 50–45 C
crystals deposited 立体反転したエポキシド 51% (4 steps) mp 240 °C (decomp) AcOH• Inaba, T.; et al. J. Org. Chem. 1999, 64, 4962.

105 オキサゾリン環の開環 (4.0 equiv) Inaba, T.; et al. J. Org. Chem. 1999, 64, 4962.
HOCH2CH2OH 120 C 20 h (18 : 82) DMF 85 C 16 h (29 : 71)

106 チオエーテルの位置異性体の生成機構 - + Inaba, T.; et al. J. Org. Chem. 1999, 64, 4962.

107 チオフェノールによるオキサゾリン環の開環
(2.0 equiv) KHCO3 (2.0 equiv) (MIBK) - reflux (117–118 C), 12 h 8 : 92 Inaba, T.; et al. J. Org. Chem. 1999, 64, 4962.

108 Nelfinavir の完成 8 : 92 Inaba, T.; et al. J. Org. Chem. 1999, 64, 4962.
PhMe > 90 C (1 h)  rt deposited crystals (81% ) washing PhMe 50% aq Me2CO reflux (4 h) washing deposited crystals drying in vacuo mp 192 C (decomp) 50% aq Me2CO

109 meso-エポキシド／オキサゾリン法（JT ルート）のまとめ
1 3 6 5 - + AcO 1 4 1 3 4 3 ABT ユニットの 3 位水酸基の 立体配置の反転が合成ルートを大幅に短縮 オキサゾリンの形成が官能基変換（水酸基の区別）を簡略化 (5R,6S)-2,2-dimethyl-5-hydroxy- 1,3-dioepan-6-ammonium acetate からの通算収率は > 50%（6 工程）

110 JT ルートで使用する原料 - + AcO

111 L-フェニルアラニン アスパルテーム ショ糖の 200 倍の甘さ 1) HI, P, AcOH, H2O reflux, 2 h
L-Phe アスパルテーム ショ糖の 200 倍の甘さ L-Phe（必須アミノ酸） L-Asp 1) HI, P, AcOH, H2O reflux, 2 h 2) NH3, H2O (pH 5–6) (67%) Ac2O, NaOAc 100 C Erlenmeyer 合成

112 2-ブテン-1,4-ジオール H2 (25–30 MPa), Raney Ni, 70–100 C または
H2 (20 MPa), Ni-Cu-Cr/SiO2, 180–200 C Reppe 反応 （0.5–2 Mpa） Cu(C≡C)2-Bi2O3/SiO2 または Cu(C≡C)2-Bi2O3/MgSiO3 100–110 C 10–30% 水溶液 H2 Fe 触媒または Ni 触媒（Fe 添加物）または Ni 触媒（Fe 添加物 + アミン阻害剤） または Pd 触媒（Zn で部分的に被毒） Thiodan （殺虫剤）

113 3-アミノ-2-メチル安息香酸 HNO3 （主生成物） 分別蒸留 bp 255 C mp 29 C o-キシレン （副生成物）
酸化 還元

114 ビタミン B2 の合成（Karrer, 1935） + 1) H2, Pt 1) HNO3 2) ClCO2Et 2) H2, Pt H2
Ni D-リボース H3BO4 アロキサン（alloxan） ビタミン B2（リボフラビン）

115 まとめ ジアゾメタンを使用する反応や低温反応は、 （工業的な実施が不可能では ないが）回避することが好ましい
ジアゾメタンを使用する反応や低温反応は、 （工業的な実施が不可能では ないが）回避することが好ましい 　 多段階合成を工業的に成功させるには、中間体の単離（分離）が簡便で なくてはならない 　 JT で開発されたルートでは、中間体（ABT）の第 2 級水酸基の立体を反転させるというアイデアで合成ルートが全体として単純化された 〈急がば回れ〉の発想 　 さらに、通常は安定なアミド結合さえ、オキサゾリンに変換して b 位にある 水酸基の活性化に利用された 〈逆転〉の発想

116 参考文献（1） 杉本正信，エイズとの闘いⅡ－新たな展開（科学のとびら 36），東京化学同人， 1999 年．
杉本正信，エイズとの闘いⅡ－新たな展開（科学のとびら 36），東京化学同人， 1999 年． 　 上村大輔・袖岡幹子，生命科学への展開（岩波講座 現代化学への入門 15）， 岩波書店，2006 年． 　 北泰行・平岡哲夫 編，創薬化学－有機合成からのアプローチ，東京化学同人， 2004 年． 　 Carter, J. B.; Saunders, V. A. Virology–Principles and Applications; John Wiley & Sons: Chichester, 　 K. Weissermel, H. -J. Jarpe 著，向山光昭 監訳，工業有機化学－主要原料と中間体，第 5 版，東京化学同人，2004 年． 　 （a）森謙治，有機化学Ⅰ－有機化学の基礎（農芸化学全書），養賢堂，1988 年．（b）森謙治，有機化学Ⅱ－官能基の化学（農芸化学全書），養賢堂，1988 年．（c）森謙治，有機化学Ⅲ－天然有機化合物を中心に（農芸化学全書） ，養賢堂，2006 年．

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