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遺伝子の解析 第2弾 DNAシークエンス法.

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1 遺伝子の解析 第2弾 DNAシークエンス法

2 DNAシークエンス (ABI PRISM310を用いて遺伝子の配列を読む)
ABI PRISM310でのシークエンス反応はサイクルシークエンス法とよばれる方法で行っています。まず、PCR反応でA,G,C,Tそれぞれに、励起する波長が異なる4種類の蛍光色素をddNTPにつける方法(Dye Terminator法)を用い、その標識されたDNAフラグメントを内径50μmのキャピラリー管のなかで電気泳動を行いA,G,C,Tそれぞれの蛍光をCCDカメラで検出し、塩基配列を読むことができます。 原理 オートシークエンサー(ABI PRISM310)の反応では合成 されるDNAを蛍光物質で標識します。 その標識されたDNAを電気泳動し、泳動中にレーザー光を当て励起光を自動で検出し、コンピューターで解析します。

3 ~DNAシークエンスの流れ~ PCRにて目的のDNA量を増やす。(同時に蛍光標識も行う) エタノール沈殿にて目的DNAの分離・精製

4 デオキシヌクレオチド(dNTP)と ジデオキシヌクレオチド(ddNTP) P P OH H 塩基 塩基 デオキシヌクレオチド(dNTP)
ジデオキシヌクレオチド(ddNTP) dNTPとddNTPはPCR法でそれぞれDNAの構成単位として利用されます。違いは3´の位置の水酸基が水素基になっていることです。NにはA,T,G,Cの4種類の塩基が当てはまります。

5 dNTPとddNTPの伸長反応の違い 伸長反応はStop OH OH dATPが 反応した場合 続く H ddATPが 反応した場合
5´末端 3´末端 A T OH 3´末端 T A OH 5´末端 続く dATPが 反応した場合 3´末端 T A H 5´末端 ddATPが 反応した場合 伸長反応はStop

6 dNTPとddNTPが一緒にあるときにPCR反応をすると・・・・
dNTPをA,T,G,Cとし、ddNTPをA*,T*,G*,C*とする A* TGCATGC 5´ 3´ テンプレートDNA ACG* TGCATGC 5´ 3´ ACGTACG TGCATGC 5´ 3´ ACGTACG* TGCATGC 5´ 3´ PCR反応 ACGT* TGCATGC 5´ 3´ A*,T*,G*,C*が取り込まれると、そこで伸長反応が停止するのでいろいろな長さ(分子量)のDNA断片が作られる

7 Dye Terminator法 塩基 H 蛍光色素 ddNTPの4種類の塩基(A,T,G,C)それぞれに異なった蛍光色素を標識することで4種類のddNTPを見分けることができる。 A T G C P H P H P H P H

8 蛍光色素で標識することで・・・・・ ほぼ同じ長さ(分子量)だが これら4種類のDNAを 区別することができる ACA* TGTATGC
ACC* TGGATGC 5´ 3´ ACG* TGCATGC ACA* TGTATGC ACT* TGAATGC ほぼ同じ長さ(分子量)だが これら4種類のDNAを 区別することができる

9 ゲル電気泳動の分子ふるい効果 DNAは負電荷を持つ高分子なので全て+極へ進みます。DNAの分子量が小さいほど(短いほど)ゲルマトリックスとのふるわれ方が少なく、進みやすくなります。このように一定時間泳動すると分子量の差によってDNAが分離されることを分子ふるい効果といいます。 ゲルマトリックス 高分子DNA 低分子DNA

10 Ex)塩基配列を知りたい(水色部分が知りたい部分)DNA
ACGTACG TGCATGC 5´ 3´ Dye Terminator法を利用してPCRをすると A* TGCATGC 5´ 3´ ACG* ACGT* AC* ACGTA* ACGTAC* ACGTACG* 出来上がったDNA断片 プライマー

11 PCRで作られたDNA断片をポリマーを充填した(ゲルと同様)キャピラリー管の中で電気泳動をすると
5´ ACG* ACGT* AC* ACGTA* ACGTAC* ACGTACG* 分子ふるい効果 により短い断片 が早く+極側へ 移動する

12 よって知りたかった塩基配列はACGTACGとなる
蛍光のついた塩基を早く+極側についた順に並べると ACGTACG ACGTACG 5´ TGCATGC 3´ 5´ よって知りたかった塩基配列はACGTACGとなる 参考文献 改訂遺伝子工学実験ノート 羊土社     バイオ実験超基本Q&A 羊土社

13 実際のシークエンス結果(一部抜粋)


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