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物語 バラバラだった大腸菌が・・・ 一か所に集まり・・・ Ｖｖ しだいに大きくなり・・・ 有限の大きさで止まります。
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私たちのプロジェクトに必要なもの ●大腸菌同士の吸着 →鞭毛にヒスタグを挿入 ●大腸菌の一か所への集合 →クオラムセンシング ●大腸菌の集合体の大きさの制御 →AHLクエンチャー
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SENDER tetR LuxI tetR FliC-His ・常にAHLを生産する。 ・常にヒスタグ付きの鞭毛を生やす。
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RECEIVER tetR LuxR aiiA pLux GFP pLux FliC-His ・常にaiiAを発現する。
・AHL存在下でGFPを発現する。 ・AHL存在下でヒスタグ付きの鞭毛を生やす。
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DESIGN Receiver Sender
Senderは常にAHLを生産します。
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DESIGN Senderが生産したAHLが届く範囲にいるReceiverはGFPを発現し、ヒスタグ付きの鞭毛を生やします。
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DESIGN ヒスタグ付きの鞭毛が生えたReceiverはニッケルイオンを仲介としてSenderの周りに吸着します。
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DESIGN ReceiverはaiiAを発現してAHLを分解します。
AHLが届く範囲が狭まり、鞭毛が生えるReceiverが制限され大腸菌の集合体の大きさが制限されます。
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FliC-System ・FliCとはE.coli の鞭毛の主要な 構造タンパク質 ・非必須ドメインを 鞭毛の外側に 露出している。
露出している。 ・FliCの非必須ドメインに、任意の タンパク質を 、鞭毛の機能を損 なうことなく挿入することができる。
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Histagged-FliC
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Histagged-FliC
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His-Tagged-FliC
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His-Tagged-FliC
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His-Tagged-FliC ・E.ColiはHistag-金属イオン作用 により互いに吸着する。
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His-Tagged-FliC ・E.ColiはHistag-金属イオン作用 により互いに吸着する。
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Phenotype check 転写 ① ④ ⑧ pET-49b M ⇒FliC-Hisの発現が確認された。
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Beads adsorption 原理 ・
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Beads adsorption RM培地 5mL ビーズ吸着 30℃ IPTG5μL Colony Check inculate 顕微鏡
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Beads adsorption ・Colony Check ・顕微鏡写真 No Metal 顕微鏡写真 No plasmid
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Toxicity Check and Cell aggregation
RM培地 5mL Add Ni2+ Co2+ (Stationary) 30℃ IPTG5μL Colony Check inculate 顕微鏡
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Toxicity Check and Cell aggregation
顕微鏡写真
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Sender aggregation RM培地 5mL Add Ni2+ Co2+ (Stationary) 30℃ IPTG5μL 顕微鏡
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Sender aggregation ・ 顕微鏡写真
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Receiver aggregation RM培地 5mL Add Ni2+ Co2+ (Stationary) 30℃ IPTG5μL
顕微鏡
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Receiver aggregation ・ 顕微鏡写真
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Quorum Sensing System LuxI and LuxR aiiA SenderとReceiverの選択ができるようにする
Sensitive Normal aiiA Receiver Strong(Super Sender) Normal
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Quorum Sensing System LuxI and LuxR aiiA SenderとReceiverの選択ができるようにする
Sensitive Normal aiiA Receiver Strong(Super Sender) Normal
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aiiA inverter Receiver
LuxR GFP aiiA pTet pLux cI inverter Low AHL High AHL GFP aiiA
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Senderの数とGFP発現 Sender:5×10^8～5×10 Receiver Sender(BW25113 or XL10G),
Methionine (10mM or 0mM) Sender:5×10^8～5×10 methionine S-adenosyl methionine 3OC6HSL(AHL) metK LuxI Methionine 0mM Methionine 10mM BW25113 5×10^4 XL10G 5×10^7
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AHL synthesis Sender:5×10^8～5×10 S-adenosyl methionine methionine
metK AHL synthesis LuxI, acyl-ACP 3OC6HSL Receiver Sender(BW25113 or XL10G), Methionine (10mM or 0mM) Sender:5×10^8～5×10
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super receiver luxR ・AHLの感度をあげるためLuxRの４５番目のIをFに変えた、mutantをつくった。 I45F
Normal receiver ｍ
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super receiver test sender sender Super Normal
現在テストに向けて進行中
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super receiver test２ ・左図のようなチューブにsuper、normalともに同じ量ずつ入れていく。
・加えるsenderまたはAHLの量をだんだんと増やしていき、superとnormalの発光の違いを観察する。 ・こんな実験ができたらいいなと進行中。 super normal
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Final-Construction
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Final-Construction 実験
鞭毛間吸着テスト（senderとreceiver同士が吸着するか確認） マリモがちゃんと形作れるかテスト サイズの制御テスト
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Absorption Test
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How to make Marimo R R Receiver O/N Culture R R Ni2+ R R R R R
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How to make Marimo 1滴 S S S R R Receiver AHL R O/N Culture R Ni2+ R R
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How to make Marimo S S S R R R R Receiver O/N Culture R AHL S Ni2+ R S
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How to make Marimo S S S R Receiver O/N Culture R R R AHL R S Ni2+ S R
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How to make Marimo S S S R Receiver O/N Culture R R R AHL R S Ni2+ S R
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How to make Marimo MARIMO! S S S R Receiver O/N Culture R R R AHL R S
Ni2+ S R S R R R R R MARIMO!
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