THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 287, NO. 15, pp

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1 THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 287, NO. 15, pp
THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 287, NO. 15, pp –11688, April 6, 2012 Autophagy Promotes Intracellular Degradation of Type1 Collagen Induced by Transforming GrowthFactor(TGF)β1 オートファジーはTGF-β1に誘導されるⅠ型コラーゲンを分解する ゼミ M1　中山千華

2 TGF-β1(Transforming Growth Factor-β1)
腎線維症 ー慢性腎臓病の進行に伴う症状であり、腎臓における不可逆的な細胞外基質の蓄積 　透析・臓器移植以外に現在有効な治療法はない TGF-β1(Transforming Growth Factor-β1) ー多様な働きを持つサイトカイン ・増殖や腫瘍形成に関わる 　Bierie, B., and Moses, H. L. (2006) Nat. Rev. Cancer 6 ・コラーゲンの合成を促進する 　 Schmierer, B., and Hill, C. S. (2007)Nat. Rev. Molecular Cell Biology, 8 ・オートファジーを誘導する Ding, Y., et al.(2010)J. Biol. Chem. 285 ・腎臓線維症とは 慢性腎臓病の進行に伴って進む症状であり、現在治療法は臓器移植以外に確証のある治療法はない。 腎臓の炎症とか➣ 生活習慣病（高血圧、糖尿病など）や、メタボリックシンドロームとの関連も深く、誰もがかかる可能性のある病気です1330万人（日本成人の8人に一人「新たな国民病） 構造のよく似た5種類のアイソフォーム(β1～β5)が存在する。このうち哺乳類で見られるのはβ1～β3の3種類。当初、TGF-βは正常な繊維芽細胞の増殖を促進する因子として分離された。その後の研究でTGF-βの主な作用は増殖抑制であるとされ、上皮細胞、血管内皮細胞、血球細胞、リンパ球などの多くの細胞に対して、増殖抑制因子として作用する物質として知られている。 血漿中濃度について、慢性肝炎において肝の繊維化進展にしたがって上昇する傾向があることや、大腸癌で上昇していることが報告されており、繊維化、免疫能、発癌など様々な疾患に関係していると考えられる。このため、臨床症状との関連が注目されている。 コラーゲンの合成はTGF-β１に誘導されるSmad経路 Dpp（decapentaplegic）はショウジョウバエのBMPのホモローグである。Dppのシグナルを修飾する遺伝子のスクリーニングの結果、Mad（Mothers against Dpp）が得られた。一方、DAF-4は線虫のBMP様因子の?型レセプターであるが、sma-2、sma-3、sma-4はその異常がdaf-4遺伝子の異常と同じ様な表現型を示す遺伝子として得られた。これらのSma蛋白質とMadはアミノ酸配列で高い相同性を示し、いずれもTGF-βスーパーファミリーの因子のシグナルを伝えることから、これらをSma+Mad = Smadと呼ぶようになった。 Gregor M.Bran. et al. (2010)Anticancer Research

3 ユビキチン分子が複数結合した標的タンパク質をプロテアソームが認識して分解する ②オートファジー経路
細胞内におけるタンパク質の分解 ①ユビキチンープロテアソーム経路 　ユビキチン分子が複数結合した標的タンパク質をプロテアソームが認識して分解する ②オートファジー経路 mTORキナーゼは、オートファジーの誘導にとって決定的な調節因子で、活性化されたmTOR (Akt及びMAPKシグナル経路) はオートファジーを抑制し、mTORの負の調節因子 (AMPK及びp53シグナル経路) はこれを促進する。酵母におけるAtg1と同様の役割を持つ、UNC-51様キナーゼ-1、-2、及び-3 (ULK1、ULK2、UKL3) という3つの関連するセリン/スレオニンキナーゼは、mTOR複合体の下流で作用する。ULK1とULK2は、オートファジー関連遺伝子産物 (Atg) の哺乳類の相同分子 (mAtg13)、及びスキャホールドタンパク質FIP200 (酵母のAtg17の直系遺伝子産物) と大きな複合体を形成する。オートファジーの誘導には、hVps34、Beclin 1 (酵母のAtg6の哺乳動物における相同遺伝子産物)、p150 (酵母のVps15の哺乳動物における相同遺伝子産物)、及びAtg14様タンパク質 (Atg14LまたはBarkor)、あるいは紫外線照射抵抗性関連遺伝子 (UVRAG) を含むClass III PI3K複合体が必要である。Atg遺伝子群は、Atg12-Atg5とLC3-II (Atg8-II) の複合体形成を通じてオートファゴソーム形成を制御する。Atg12は、Atg7とAtg10 (それぞれE1及びE2様酵素) を要求するユビキチン様の反応によってAtg5に共有結合する。このAtg12-Atg5複合体は、次にAtg6と非共有結合による相互作用によって大きな複合体を形成する。LC3/Atg8はAtg4プロテアーゼによってC末端で切断され、細胞質内にLC3-Iを生成する。LC3-Iは、Atg7及びAtg3 (それぞれE1及びE2様の酵素) を要求するユビキチン様反応によって、ホスファチジルエタノールアミン (PE) と共有結合をする。LC3-IIとして知られる脂質結合型LC3は、オートファゴソーム膜に結合する。 Singh, R. (2011). Aging (Albany NY), 3(10), 934.

4 ⇩ 本実験の背景と目的 ●TGF-β1がコラーゲン産生を促進し、腎線維症を引き起こす
Sharma,K.,andZiyadeh,F.N.(1995)Diabetes44 ●分子シャペロン欠損細胞ではⅠ型コラーゲンの立体構造の形成が不完全となり、オートファジー経路を介した細胞内分解の標的となる Ishida, Y., et al.(2009)Mol.Biol.Cell20 ●TGF-β1がオートファジーを誘導する Ding, Y., et al.(2010) J. Biol. Chem. 285 　⇩ 筆者らは、腎線維症の治療法解明のためにⅠ型コラーゲン蓄積量の調節におけるオートファジーの役割を検証した。 TGF-β1はSmad経路を介してコラーゲン等の細胞外基質の合成を促進することが知られている。細胞外基質の過剰な蓄積は末期腎不全の主な症状である腎線維症を引き起こす。近年、蓄積した細胞外基質の分解には酵素であるMMPs以外にオートファジーが重要な役割を担っていると考えられている。 また、筆者達は以前にTGF-β1がオートファジーを誘導することを報告しており、

5 Fig①beclin 1 +/-マウスではコラーゲンが蓄積される
腎臓組織切片を A マッソントリクローム法で染色 (筋線維=赤、コラーゲン=青、核=紫) B ウエスタンブロット 100 µm 100 µm ・ベクリン遺伝子のホモ欠損マウスは生存不可能（？） ・ベクリンヘテロ欠損はオートファジー能力が５０％以下、ノーマルと比べてbasal　autophagic fluxが下がる ⇒オートファジーはコラーゲン分解を促進するのか？オートファジー活性の低下はヘテロ欠損マウスの腎臓においてコラーゲン蓄積を増加させるの？検証 ベクリン欠損によりコラーゲンは増加、組織全体のlysateウエスタンからもベクリン欠損マウスの組織ではコラーゲン量で2.４倍の増加が認められた。 まるいのは糸球体 Masson tricrome stain 膠原線維を選択的に染めることで、アザン染色と同じ目的である膠原線維と筋線維を染め分ける特徴をもつ。 核をヘマトキシリンで染め、細胞質を赤く、膠原線維を青く染める、３色染色とよばれる

6 Fig②培養細胞での確認 A MMCをTGF-β1(2 ng/mL)で刺激(0~24h)→ウエスタンブロット
B siRNAによりノックダウン→TGF-β1(2 ng/mL)で刺激→ウエスタンブロット 次にマウスの腎臓のメサンギウム細胞を用いてベクリンの減少がコラーゲンの量を増加させるかどうか検討した。 (ベクリン欠損マウスから得た培養細胞) A　ベクリンの発現が減少すると、COL1の発現が増加している(0hのところ)　またTGF刺激によって時間依存的に増加(黒色バー) B　siRNAを用いたベクリンのノックダウンも同様の結果 …ベクリン遺伝子発現が回復しているから差が縮まっている TGFによるコラーゲンの過剰な蓄積を抑制するためのメカニズムとしてオートファジーが働いていることが示唆される。

7 NOTE: Longer transfection times may be desirable depending on the cell line. However prolonged serum starvation may result in unwanted cell detachment or death. NOTE: Fluorescein Conjugated Control siRNA should only be incubated for a total 5-7 hours at 37° C in a CO2 incubator. At the end of incubation they are ready to be assayed by fluorescent microscopy. Add 1 ml of normal growth medium containing 2 times the normal serum and antibiotics concentration (2x normal growth medium) without removing the transfection mixture. If toxicity is a problem, remove the transfection mixture and replace with 1x normal growth medium. Incubate the cells for an additional hours. Aspirate the medium and replace with fresh 1x normal

8 Fig③オートファジー経路の阻害によりコラーゲンの分解が抑制される
TGF-β1(2 ng/mL), Baf A1(10 nM), MG132(10 µM) ↓24h A ウエスタンブロット　 B PCR ・隔離膜に存在するベクリン１はオートファオゴソームの形成に重要であり、ベクリン１欠損はオートファジー活性化を抑制する(２５，２６) ・fig1/2より、ベクリン１のヘテロ欠損あるいはsiRNAによるノックダウンはMMCにおけるコラーゲン量の増加を誘導する。 ブァフィロマイシン（４０．４１）：オートふぁごそーむとりそそーむの結合を阻止するorリソソーム内の酸性化を阻止してりーそそーむによる組織やタンパク質の分解に影響を与える そこで、オートリソソーマルタンパク質の分解を阻害することにより、同様にⅠ型コラーゲン量が増加するか検討した A COL１タンパク質はBaf処理により大きく増加　→TGF-β(Smad経路)によりさらに増加　ユビキチンンプロテアソーム阻害剤MG132は増加させなかった　lane3 vs 6 　LC3はオートファジーが進むにつれ分解されるものであるがオートファゴソームの外側のLC3-IIはAtg4によってPEから切断され、再びLC3-Iに戻ることが出来ますが、オートファゴソームの内側のLC3-IIは、オートファゴソームがリソソームと融合すると分解されます。 BafによりLC3Ⅱの分解が阻害されていることが分かる ➣UPS経路ではなくオートリソソーマルタンパク質の分解経路が内在性COL1の分解に重要であることがわかる Aの結果のBafの影響がCOL1タンパク質増加がｍRNAの増加ではないことを示すためにPCR B　同じサンプルを用いて　TGFによる刺激はｍRNA増加したがBaf処理によるｍRNAの変化はなかった　 BafA　オートりそそーむ阻害剤により、COL1のｍRNA量には変化はなく分解が阻害された Bafだけの処理はbasalのTGFなしでもオートファジー活性があることを示している。（LCⅡの増加） Bafとは違いMG１３２によるプロテアソーム阻害はCOL1を抑制した BafA1(bafilomycin A1)：オートリソソーム形成阻害剤 MG132：ユビキチン‐プロテアソーム経路阻害剤

9 GFP-LC3トランスジェニックマウス由来MMCを播種 ↓24h
TGF-β1(2 ng/mL), Baf A1(10 nM), MG132(10 µM) 蛍光免疫染色 次に、オートファゴソームを形成していることを示すLC3とCol1の共局在の有無を検討した C　Baf とBaf＋TGFはCOL1と同様にオートファゴソーム の量を増加した(緑の点)　　これはAのウエスタンと一致(LC3Ⅱの増加) リソソームとの結合を阻止するBaf　リソソームとくっついてない　コラーゲンを含むオートふぁっじーが増える D　リソソームのマーカーLAMP１抗体を用いて同様に検討→BaｆとBas＋TGFで共局在増加 ➣MMC内のCOL1量はオートリソソーマル経路を介した分解により調節されていることが分かった

10 Fig④TGF-β1に誘導されるⅠ型コラーゲンはオートファジーの活性化によって減少する
＊TFP処理の条件検討 TFP 処理→A・Bウエスタンブロット TFP(20 μM) or/and TGF-β1(2 ng/mL) 24h処理→C 蛍光顕微鏡によりGFP-LC3を観察 オートふぁじーの活性化が進むと脂質膜結合型のLC3であるⅡ型のLC3が増えるためこの量をオートファジー活性の指標とした　←どういうことか？ トリフルオペエラジンはオートふぁじーの活性剤 A　BともにLC3Ⅱが増えていく ベクリン１については明らかな変化は認められなかった　←これでもいいの？ C　aに比べてbは点が見える　ｄではより点が多く TFP：オートファジー活性剤

11 Fig④TGF-β1に誘導されるⅠ型コラーゲンはオートファジーの活性化によって減少する
＊TFP処理により誘導されるオートファジーはⅠ型コラーゲンの分解を促進するか検討した TFP(20 μM) or/and TGF-β1(2 ng/mL) 24h処理→D：ウエスタンブロット、E ：PCR 次に、TFPに誘導されるオートファジーはTGFによるCOL１を減少させるかどうか検討した D　TGF刺激によるCOL1の増加をオートファジーアクチベーターであるTFPは抑制した E　しかしTFPはCOL１のｍRNA量発現を抑制したわけではない →発現ではなく生成されたタンパク質のオートファジー分解によるもの→オートファジー経路はTGF-ｂ１によるCOL1の蓄積を防止する

12 Fig⑤COはオートファジーを誘導する ウエスタンブロット A 大気 or CO(1・3d)に曝したマウスから単離した腎臓組織
B　大気 or CO(0 – 24h)に曝したMMC 少量の一酸化炭素(250ｐｐｍ)はオートファジーを促進する(48) Carbon Monoxide Activates Autophagy via Mitochondrial Reactive Oxygen Species Formation 筆者たちは以前にCO処理はマウスにおいてUUO後の腎臓におけるコラーゲン蓄積を抑制したことを報告している　TGFBによるASMAやコラーゲンとかの蓄積をCOは抑制している UUO：一側尿管結紮. （unilateral ureteral obstruction; UUO）による腎尿細管障害…ECMの増加、尿細管間質の線維化を引き起こす つまりオートファジーを介した経路が部分的にコラーゲンの分解に寄与ているのではないかと仮定した A/B　COはTFPと同様に時間依存的にベクリン１とLC３を増加した COもまたin vivo腎臓 vitro　MMCともにオートファジーを誘導することが示された

13 Fig⑥COに誘導されたオートファジーがⅠ型コラーゲンの蓄積に与える影響
ウエスタンブロット A CORM-2(0~20 µM) 24h処理 B CORM-2(10 µM)、TGF-β1(2 ng/mL) 24h処理 C CORM-2(10 µM)、BafA1 (10 nM) 24h処理 A　CORM-2はCOを細胞に届ける分子であり、COガスにさらすのと同様の効果が報告されている。 →CORM-2もまたオートファジーを誘導することが示された 次に、　COに誘導されるオートファジーはTGF-β１によるCol1の蓄積にどのような影響を与えるか検討した。 B　左のノーマルMMCでは、TGF-βによるCol１を減少させているが、右のベクリン１が欠損しているMMCではオートファジーが働かないため、Col１の量に変化はない また、ベクリン発現しているノーマルMMCではTGF-βによる刺激に関わらずbasalにCoｌ１の量が減少しているが、ベクリン欠損MMCでは変化ない　　…もともとのTGF-β刺激によらないオートふぁじー能も抑制　COがオートふぁじーを引き起こす経路には関係がない、とういうこと？ C　ノーマルのベクリン発現型MMCにおいて、オートリソソームを分解するBafA1を用いてオートファジー経路を抑制すると、CORM-2によるTGF-βによるCol1の蓄積を抑制しないことが分かった。 D　TGF-β処理したMMCにおいてCORM-2はCoｌのｍRNAを減少することによる蓄積の減少ではない

14 Fig⑦TGF-β1はTAK1－MKK3シグナル経路を介してオートファジーを誘導する
A TGF-β1(2 ng/mL) 0-24 h処理→ウエスタンブロット B MKK3発現ベクター / TGF-β1(2 ng/mL) 24h処理→ウエスタンブロット C TGF-β1(2 ng/mL) 24 h処理→蛍光顕微鏡によりGFP-LC3を観察 ・TGF-βはヒト癌化細胞などでおーとふぁじーを誘導することが報告されているが、そのメカニズムは完全には解明されておらず、また細胞腫特異性であるようだ ・以前に筆者達はTGFはMMCでオートファジーを誘導し、TAK1の活性化がTGF-βに誘導されるLC3の発現に重要であることを見つけている。 →ここでは、TAK1のすぐ下流にあるMAPキナーゼキナーゼ3MKKがベクリン１とLC3の発現を会してTGF-βによるオートファジーの誘導を調節するのかどうか検討した。 A　MMK欠損マウスにおけるもともとのベクリン１とLC3発現はMMKノーマルの左のメンブレンに比べて低い　１vs　6 MMKノーマルマウスではTGF 刺激後の時間依存的にLC3ー１/２発現が増加しているが、MMK欠損では同様の傾向は認められない。　ベクリン１も同じ。　 ベクリン１はLC3に比べて発現量は少ない B 　MKKのreconstitionはTGFによる刺激を回復させた　lane4 C　TGF]刺激によりMKKノーマルでは点状のGFP-LC3が検出できるがｄのMKK欠損では見れない →TGF-β1はTAK1－MKK3シグナル経路を介してオートファジーを誘導する

15 Fig⑧オートファジーは凝集したコラーゲンを分解する
A 野生型のマウス由来MMCをウエスタンブロット　with or without DTT(100 mM) B ベクリン1欠損/野生型マウス由来MMCからタンパク質を抽出 　→沈殿と上清に分けてウエスタンブロット これまでの研究で、MMｃにおいてオートファジーがCoｌの分解を行うことは分かったが、どのようにしてCoｌ１を隔離するのか？ 最近の研究で、Hsp47欠損繊維芽細胞において、ミスfoldされた三量体Ⅰ型コラーゲンは小胞体で凝集して蓄積し、オートファジーにより除去される、ことが分かっている →今回、ベクリン１欠損によりオートファジーが行われないMMCにおいて凝集した三量体コラーゲンが増加するかどうか調べた A　DTTなしの溶解バッファーを用いた細胞の抽出物からは三量体のコラーゲンが検出された。　DTTは還元状態にしS=S結合の形成を防ぐ。コラーゲンの凝集はS=Sを介するため、DTTがあると凝集タンパク質の検出ができない B　S/soluble 上清　P/pellet　沈殿　より凝集して高分子になったもの ベクリン１ノーマルでは沈殿においてCol-1量がより少ない。　しかしベクリン欠損ではCOL-1の量多い。ペレットではさらに ベクリン欠損型において、TGF-β１の刺激により、ペレット内の凝集Col-1が増えた →オートファジー活性の阻害はER（小胞体？）内でのコラーゲンの凝集を刺激する。　　よって、コラーゲン分解はオートファジーに大きく依存するようだ。

16 総括 ➣TGF-β1は相反する二つの性質をもつ ①Col-1合成促進 ②Col-1分解を誘導するオートファジー促進
（ベクリン1発現の抑制　/ Baf A1処理） ・mRNA発現量に変化はない ・オートファジー促進によるCol-1蓄積⇩ （ TFP処理 / CO曝露） 皮膚におけるコラーゲン量の低下に栄養条件が悪いことが挙げられる オートファジーが誘導され 、オートファジーが引き起こされているのも関係しているのではないか ROSがオートファジー促進 ▶TGF-βに誘導されるオートファジーのCol-1分解促進作用は、 　腎線維症の治療に利用できる可能性がある