環境応答生理学 Class-7 (July 13, 2016) Physiology of Environmental Responses 塩ストレス環境とイオン輸送系 その２（イオン輸送の最新研究）、 環境応答生理におけるシグナル伝達、細胞死、放射性物質、GMO Salt stress1 (theory.

Presentation on theme: "環境応答生理学 Class-7 (July 13, 2016) Physiology of Environmental Responses 塩ストレス環境とイオン輸送系 その２（イオン輸送の最新研究）、 環境応答生理におけるシグナル伝達、細胞死、放射性物質、GMO Salt stress1 (theory."— Presentation transcript:

1 環境応答生理学 Class-7 (July 13, 2016) Physiology of Environmental Responses 塩ストレス環境とイオン輸送系 その２（イオン輸送の最新研究）、 環境応答生理におけるシグナル伝達、細胞死、放射性物質、GMO Salt stress1 (theory and molecular aspect), Signaling, Cell death, Radio isotopes, GMO 課題論文　Topic paper Arabidopsis decuple mutant reveals the importance of SnRK2 kinases in osmotic stress responses in vivo Fujii H et al. PNAS 2011;108:

2 環境ストレスと細胞内シグナル伝達（前回既出）
Intracellular signaling against environmental stresses(Previously appeared) 受容　→ Reception 　伝達 Transmission 10 SnRK2 genes (Arabidosis) 　転写因子　→ Transcriptional factor ABA-independent Drought (osmotic) tolerance 　シス因子　→ Cis-elements ABA response

3 Isolation of the decuple mutant.
Isolation of the decuple mutant. (A) RT-PCR analysis with SnRK2s and Tubulin primers using total RNA extracted from seedlings of the wild type (Col-0) and the decuple mutant as the template. (B) Photograph of wild type (WT) and snrk2.2/3/6 (236), snrk2.1/4/5/7/8/9/10 septuple (sep), snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple (dec), and snrk2.1/3/4/5/6/7/8/9/10 nonuple (2W) mutant plants. The plants were grown in soil for 4 wk after transfer from MS plates on which the plants had germinated and had been identified. (Scale bars: 1 cm.)‏ Hiroaki Fujii et al. PNAS 2011;108: ©2011 by National Academy of Sciences

4 Phenotypes of srk2d/i and srk2d/e/i mutants.
前回既出　(Previously appeared) Phenotypes of srk2d/i and srk2d/e/i mutants. SnRK2D = SnRK2.2 SnRK2E = SnRK2.6 SnRK2I = SnRK2.3 Nakashima K et al. Plant Cell Physiol 2009;50: 　　　　ABA 種子　　　　　　休眠 (dormant) 　　三重変異体 (Triple mtant) 種子　　　　　　休眠解除 (no dormat) ABA response１：種子休眠 seed dormancy ABA responce2：ストレス耐性 stress tolerance

5 In-gel kinase assay. In-gel kinase assay. In-gel kinase assay with proteins extracted from the wild type (Col-0) and snrk2.2/3/6 (236), snrk2.1/4/5/7/8/9/10 septuple (sep), and snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple (dec) mutants grown in liquid culture with or without a 20-min exposure to 0.8 M mannitol. Histone was used as the substrate. In the autoradiograph (Upper), the upper, middle, and lower activated bands are indicated by an arrow, a closed arrowhead, and an open arrowhead, respectively. Asterisks indicate noninduced bands. (Lower) Relative radioactivity (mean ± SEM, n = 3) of the lower, middle, and upper bands with mannitol (mann) or without mannitol (cont) normalized relative to band activity of the wild type without mannitol. Col-0 and the snrk2.2/3/6 triple, the septuple, and the decuple mutants are indicated by W, t, s, and d, respectively. Hiroaki Fujii et al. PNAS 2011;108: ©2011 by National Academy of Sciences

6 Seedling growth under osmotic stress.
Seedling growth under osmotic stress. (A) Photographs of seedlings 18 d after transfer to the control medium (1/2 MS/1% sucrose) or medium containing PEG (−0.4 MPa). (B) Seedling fresh weight and root length for seedlings treated as in A. For fresh weight determination, two seedlings were weighed at one time, and the weight was divided by two. Values are means ± SEM (n = 5 for fresh weight and 10 for root length). Col-0 and the snrk2.2/3/6 triple, the septuple, the decuple, and the nonuple mutants are indicated by WT, t, s, d, and 2W, respectively. Hiroaki Fujii et al. PNAS 2011;108: ©2011 by National Academy of Sciences

7 ABA and H2O2 contents of the mutants under osmotic stress.
ABA and H2O2 contents of the mutants under osmotic stress. ABA (A) and H2O2 (B) contents were measured in the wild type (WT) and in the snrk2.2/3/6 triple (t), the septuple (s), and the decuple (d) mutants 12 h after transfer to control medium (1/2 MS/1% sucrose) or to medium containing PEG (−1.2 MPa). Values are means ± SEM (n = 3). Hiroaki Fujii et al. PNAS 2011;108: ©2011 by National Academy of Sciences

8 Expression of genes induced by osmotic stress.
Expression of genes induced by osmotic stress. (A) Expression of osmotic-stress–upregulated genes RD29A, NCED3, RD26, and PKS5 assayed by quantitative RT-PCR in Col-0 (WT) and the snrk2.2/3/6 triple (t), snrk2.1/4/5/7/8/9/10 septuple (s), and snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple (d) mutant seedlings grown in liquid culture with or without a 3-h exposure to 0.8 M mannitol. Values are means ± SEM (n = 3 for RD29A, RD26, and PKS5, n = 5 for NCED3). (B) Histogram of gene expression in mutants expressed as a percentage of expression in the wild type based on microarray analysis. The bars indicate the number of genes showing the indicated relative expression, and the x axis is arranged in 11 consecutive groups (0% to <20%, ≥20% to <40%, ≥40% to <60%, —, ≥180% to <200%, and ≥200% expression relative to the wild type). (Upper) Expression of 464 mannitol-induced genes after mannitol treatment in the snrk2.2/3/6, the septuple, and the decuple mutants. (Lower) Expression of the same genes without mannitol treatment in the decuple mutant. Hiroaki Fujii et al. PNAS 2011;108: ©2011 by National Academy of Sciences

9 Osmotic stress or ABA-induced accumulation of proline and IP3.
Osmotic stress or ABA-induced accumulation of proline and IP3. (A) Proline content measured in liquid cultured seedlings of the wild type (WT) and the snrk2.2/3/6 triple (t), the septuple (s), and the decuple (d) mutants before (control) and after a 12-h exposure to 0.8 M mannitol. Values are means ± SEM (n = 3). (B) Proline contents of the wild type (WT) and the snrk2.2/3/6 triple (t), septuple (s), and decuple (d) mutants with or without a 96-h exposure to ABA on MS media plate with 3% sucrose. Values are means ± SEM (n = 3). (C) Proline contents of the wild type (WT) and the snrk2.1/4/5/10 quadruple (quad) and snrk2.1/4/5/9/10 quintuple (quin) mutants with or without a 96-h exposure to 10 μM ABA on MS media plate without sucrose. Values are means ± SEM (n = 3 for Col-0 and quadruple, n = 6 for quintuple). (D) IP3 content measured in liquid culture of the wild type and the snrk2.2/3/6 triple (t), the septuple (s), and the decuple (d) mutants before (control) and after a 20-min exposure to 0.8 M mannitol. Values are means ± SEM (n = 3). Hiroaki Fujii et al. PNAS 2011;108: ©2011 by National Academy of Sciences

10 Supporting information

11 Seedling growth under osmotic stress.
236またはt ：snrk2.2/3/6 ３重変異体 (2.2と2.3と 2.6の３つが欠損しているという意味) quad：snrk2.1/4/5/10の４重変異体 quin: snrk2.1/4/5/9/10の５重変異体　 sまたはsep：snrk2.1/4/5/7/8/9/10 の７重変異体 dまたはdec：１０重変異体（すべて欠損） 2W:2:2だけが機能していて他の9つは欠損変異体 WT：野生型（すべてのSnRKが機能している） Seedling growth under osmotic stress. さらなる役割分担/微調節 another role Proline accumulation 浸透圧ストレスに応答して蓄積

12 シグナル伝達 Signal transmission
環境 Environment レセプター Receptor 植物ホルモン Plant hormones cross talk シグナル伝達 Signal transmission 転写制御 (translational regulation) 遺伝子発現 Gene expression Protein or metablosim 転写後制御 (post-translational regulation) 表現型 Phenotype

13 RCAR1: Regulatory Component of ABA receptor1 （酵母TwoHybrid）
アブシジン酸受容体 Receptor of Abscisic acid found in 2009　 ＜2006～7年にかけての発表(natureとscience）は、いずれも撤回された。＞ 2009年に報告されたものが本物 RCAR/PYR/PYLタンパク質（タイプ２C protein phosphatase　結合蛋白） Science 324:1064 および　同　324:1068 (2009)　　 RCAR1: Regulatory Component of ABA receptor1 　 （酵母TwoHybrid） PYR1: PYRABACTIN RESISTANCE (ABAアゴニスト：活性化物質） S. Y. Park, P. Fung, N. Nishimura, D. R. Jensen, H. Fujii et al. Abscisic acid inhibits type 2C protein phosphatases via the PYR/PYL family of START proteins. 発芽成長阻害剤 タンパク質脱リン酸化酵素PP2C = ABI その変異体(abi)がABA Insensitive （ABA関連反応が失われる） として知られていた 他のABA関連変異体aba：ABA合成酵素の変異 other ABA mutant aba ：ABA synthesis mutant

14 A model of (+)-ABA-induced ABI1 regulation by PYL1.
K Miyazono et al. Nature 462, (2009) doi: /nature08583 ABA response１：種子休眠 seed dormancy ABA responce2：ストレス耐性 stress tolerance Drought 10 SnRK2 genes (Arabidosis) ABAとトランス因子、シス因子 （partial of previous one） ABA responce３：気孔閉鎖 Closing stomata OST1=SnRK2.6=SnRK2E ストレス耐性関連遺伝子の発現 Tolerance gene expression

15 ctr1 WT エチレン(Ethylene) 果実の成熟制御 (Fruit ripening)
成長制御 (Growth regulation) エチレン受容体ETR１ Ethylene receptor ETR1 三重応答： Triple response　 フック Hook 太く短い茎 Thick stem 太く短い主根 Thick root Air　Ethylene　Air 二成分（ヒスチジンカイネース）系 MAPKカスケード相当シグナル伝達 （後述） MAPK-cascade-like (see later) Two-Component Signal Transduction Pathways in Arabidopsis. Hwang et al. Plant Physiology, 2002, 129:500–515

16 Cytokinin: cell division↑, aging↓ Arabidopsisの例
ここにMAPKシグナル経路 （後述） Figure 9.   Model of the two-component signal transduction pathways in Arabidopsis. The cytokinin signal is perceived by multiple His protein kinases at the plasma membrane. Upon perception of the cytokinin signal, His protein kinases initiate a signaling cascade via the phosphorelay that results in the nuclear translocation of AHPs (Hwang and Sheen, 2001). Activated AHPs may interact with sequestered ARRs or ARR complexes, transfer the phosphate to the receiver domain of its cognate B-type ARR, releasing these activation-type ARRs from putative repressors in the nucleus. The dephosphorylated AHP shuttles back to the cytosol, where it can be rephosphorylated. The liberated ARRs bind to multiple cis elements in the promoter of target genes. The activation of the repressor-type ARRs as primary cytokinin response genes provides a negative feedback mechanism. In addition to the CTR1 signaling pathway, additional ethylene signaling pathways could be mediated by two-component components (Lohrmann and Harter, 2002). Red light and cytokinin signaling is converged at ARR4. ARR4 stabilizes the active form of PHYB by inhibiting dark reversion (Sweere et al., 2001). Stress and Glc may also modulate two-component signaling (Urao et al., 1998; F. Rolland and J. Sheen, unpublished data). RD, Response domain; BD, DNA binding domain; AD, transactivation domain; PM, plasma membrane; N, nucleus; R, putative repressor; FR, far-red light

17 らん藻で研究が進んでいる、ヒスチジンカイネース系
Histidine kinase system is well studied in cyanobacterium Hypothetical scheme for the pathway for low-temperature signal transduction in Synechocystis 　Suzuki et al. Biochem. Soc. Trans. (2000) 28, 628–630 低温ストレス応答の場合 (in case of cold response) Desaturace Fatty acid desaturation (不飽和化） Higher crystallized temperature Membrane fluidity sustain (流動性） Less freezing injury Among several hisditine kinase, Hik33 works as cold and osmotic sensor/receptor.

18 浸透圧ストレス応答の場合 (in case of osmotic response)
How to evidence In Cyanobacterium Five Histidine Kinases Perceive Osmotic Stress and Regulate Distinct Sets of Genes in Synechocystis Paithoonrangsarid et al. J. Biol. Chem., (2004) 279:

19 植物の ＭＡＰＫinase系 (Plant MAPK Cascade) なぜカスケード？Cascade？
Nature 451, (2008) "Dual control of nuclear EIN3 by bifurcate MAPK cascades in C2H4 signalling." Yoo et al. Model of the bifurcate MAPK cascades in ethylene signalling. The two EIN3 phosphorylation sites (P) with opposite functions are marked. Without ethylene, CTR1 directly or indirectly inactivates MKK9–MPK3/6 and probably activates downstream MAPKs to phosphorylate T592 to promote EIN3 degradation. Ethylene inactivates CTR1 for MKK9–MPK3/6 activation and T174 phosphorylation to stabilize EIN3. Arrow and blunt ends indicate positive and negative regulations, respectively. ACS, ACC synthase; MKKK, MAPKKK; C, cytoplasm; N, nucleus. （In case of cell division) 名古屋大学植物発生学研究室資料） なぜカスケード？Cascade？ 増幅　　調節　　分岐・統合 Amplify Regulate Branching

20 Jasmonic Acid　Signaling
ジャスモン酸のシグナル伝達系 果実の熟化　（エチレン生合成経路に関係） 休眠打破 落葉の促進　 塊茎形成誘導　（JA　地上→地下） 傷害応答/防御応答 Jasmonoyl-isoleucine (JA-Ile), an amino acid-conjugated form of JA SCF-type E3 ubiquitin ligase SCFCOI1 (Receptor) See Annual Review of Plant Biology (2010) in ditail JAsmonate ZIM-domain (JAZ) repressor proteins クロストーク Cross talk JA regulates numerous physiological processes in response to environmental and developmental cues. FACs, fatty acid-amino acid conjugates; GLVs, green leafy volatiles. Schematic of the three-sided antagonistic signaling network between plant hormones in stress responses.

21 ホルモン制御系やシグナル伝達系はなぜ複雑なのか？
Why so complex in signal transmission pathway? 多重性（因子、経路） Multiple-crosstalk 「植物ホルモンのシグナル伝達」より Plant Physiology 154:567 (2010) BMC Plant Biology 11:163 (2011) 現代の自動車 ＋ AT ABS Kick-down reglation ・・・ 初期の自動車　 　アクセル 　ブレーキ Fine and efficient regulation, cross-talk, multi-safety system

22 細胞死 Cell death Necrosis 壊死 Programmed cell death プログラム細胞死
　programmed or stress-induced (Apoptosis in animal cells アポトーシス） 植物でプログラム細胞死が起こる場所／機会 (Tissue and timing in plants)

23 Stress signal Disease Injury PCD (Programmed Cell Death) in function
Nuclear PCD “off” Stress signal Physiological signal Tissue homeostasis Removal of damaged cells Nuclear PCD “on” Morphogenesis Disease Injury apoptosis

24 オオムギ根での塩ストレス誘導性細胞死 Salt-stress induced cell death in barley
PCD in normal condition 　道管の形成 (xylem) 　破生間隙の形成(aerenchyma) Salt stress-induced cell death 高濃度の塩ストレスによる根の伸長成長の停止は細胞核の崩壊を伴う細胞死を引き起こしていた Control (up) 500mM NaCl 12 hr (middle) 500mM NaCl 24 hr (down)

25 中程度の塩ストレスによる根の伸長成長の停止 Root elongation stops undermild-stress (100-200 mM NaCl)
細胞は死んでいない (No cell death) 膨圧の減少による伸長する力の消失 (Turgor loss) 伸長域での形態異常　→細胞壁/細胞骨格の問題？ Cell wall or cytoskeleton?

26 Nuclear DNA degradation under storng stress (500 mM NaCl)
強い塩ストレスを受けた根の細胞死 Nuclear DNA degradation under storng stress (500 mM NaCl)

27 TUNEL TdT-mediated dUTP nick end labeling TdT: terminal deoxynucleotidyl transferase

28 DAPI TUNEL Control Stress 1h

29 A model of “point-of-no-return”
VPE proteinase in PCD（VPE: Vacuolar Processing Enzyme） Non-silenced (pPVX) ↓　←　ＴＭＶ感染 ＨＲ（TNV封じ込め） VPE-silenced (pPVX: VPE) ↓　←　ＴＭＶ感染 ＨＲおこらず（→全身感染へ） N. benthamiana plants were infected with TMV on halves of their leaves (indicated by asterisks). (Hatsugai et al. Science 305:855, 2004のFig.2より) A model of “point-of-no-return” 京都大学大学院理学研究科　西村いくこ　研究室

30 Point-of-noreturn 植物が本来もつ自己防衛能力を強化させる技術
細菌の感染後に細胞内の液胞の膜と細胞膜とが融合し、細胞の中と外がつながるトンネルが形成される 細菌感染に応答して誘導される膜融合（トンネル形成）とそれによる抗菌物質の放出と過敏感細胞死のモデル 京都大学大学院理学研究科　西村いくこ　研究室 植物が本来もつ自己防衛能力を強化させる技術 Enhancement of endogenous defense ability ストレス誘導性細胞死の抑制／制御技術 Regulation/reduction of stress-induced cell death 細胞死の研究目的 Goal of death study

31 PCD in animal cells (for reference)
動物細胞のプログラム細胞死（参考） PCD in animal cells　(for reference) Receptor with deth domain Caspase with death effecter Downstream Caspase Nature Reviews Molecular Cell Biology 4, (2003)

32 遺伝子改変植物（GMO) ２０１２年のＧＭＯ栽培面積： 世界で１億７０００万ha （２８カ国）
現在栽培されているＧＭＯ：　除草剤抵抗性と害虫抵抗性 　　soybean maize　cotton canola（なたね）　big4 is total ９９％ 市場規模：年間約148億USドル（種子販売として） 　International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applicationsz（ISAAA) 資料 Soybean 82％ Maize 30％ Cotton 68% Canola 25% are GMO 消費者の不安　(Consumer side) 　安全性　消費者／生産者の対立 生産者の利点　(Farmer side) 　コスト　利便性 組換え作物は、世界の食糧確保や貧困や飢餓の緩和に役に立つのか？ (Food supply side)

33

34

35

36 Soybean Cotton Corn Canola

37 除草剤抵抗性作物 herbicide resistance
In soybean, canola, maize, cotton 手作業での除草ではとても時間と労力がかかる 雑草Ａ 雑草Ｂ 大豆 従来の除草剤による除草ではいろいろな除草剤を 組み合わせて使わなければならない 生産性向上には除草は不可欠。大規模農業では手作業での除草は非現実的。 特に大豆栽培では除草が大きな労働となる。 従来（非組換え）でも複数の除草剤を組合わせて使用しているケースが多い。 日本国内では、トラクターなどによる中耕培土という、方法で除草することも多い。 （イラストはSTAFFの資料を改変） 除草剤で枯れない 遺伝子組換え大豆 種まき後 に使う 雑草Ａを 枯らす 雑草Ｂを 枯らす １種類の除草剤で除草が可能

38 グリホサート抵抗性大豆（ラウンドアップレディー）の例
除草剤抵抗性の効果 グリホサート抵抗性大豆（ラウンドアップレディー）の例 除草剤散布前 除草剤散布2週間後 除草剤耐性の組換え作物が出現する前からグリホサート（商品名ラウンドアップ）は使われいた。 グリホサートは残留性、毒性が低く、従来の除草剤を使うより環境負荷が少ないとされる。 グリホサート耐性は、ラウンドアップレディというモンサント社の登録商標で、大豆以外にも使われている。 他にも除草剤耐性は使われているが、グリホサート耐性がおそらく、一番広く使われるている除草剤耐性である。 アルファルファや芝でもラウンドアップ耐性が開発されている。 グリホサートは特許が切れているため、ラウンドアップ以外のジェネリック製剤が売られている。 日本では、ラウンドアップの販売は日産化学が行なっており、日本モンサントではない。 グリホサートの大豆栽培への利用は、日本では農薬取締法で禁止されており、グリホサート耐性大豆は現行法では、商業栽培はできない。 グリフォサートのLD50は3000mg以上なので動物への毒性は殆どないと考えられるが、添加剤などの影響でラウンドアップはオタマジャクシに毒性が強いという報告もある。 グリホサート（商品名：ラウンドアップ） 組換え体の栽培以外にも普通に使われている。 植物のアミノ酸合成を阻害。人間を含む動物への毒性が低い。 土壌中微生物により比較的容易に分解。残留性が低い。 写真提供：日本モンサント

39 除草剤抵抗性の仕組み グリホサート抵抗性の場合 グリホサートはアミノ酸合成に必要なEPSPSを阻害
糖 sugar 耐性植物にはグリホサートに阻害されないEPSPS（CP4 EPSPS）の遺伝子が導入されている 解糖系 ホスホエノールピルビン酸 PEP ホスホエノールピルビン酸 EPSPS EPSPS CP4 EPSPS グリホサート （５-エノールピルビルシキミ酸-３-リン酸合成酵素） グリホサートに阻害される グリホサートに耐性 シキミ酸経路 shikimic acid pathway （動物にはない） グリホサートはシキミ酸経路のEPSPSの阻害剤。 この酵素の阻害により芳香族アミノ酸が合成されなくなり全ての植物が枯死。 除草剤耐性植物（ラウンドアップレディ）は、グリホサートによって阻害されないEPSPSの遺伝子を持つ。 耐性遺伝子（CP4 EPSPS）はアグロバクテリウムの遺伝子である。 （様々な遺伝子が試されたが、最終的にアグロバクテリウムの遺伝子が効果的であった）。 除草剤耐性は、このように本来除草剤によって阻害される酵素の耐性型を用いる場合以外に、除草剤を分解する酵素遺伝子を入れる場合や、除草剤の排出に関する遺伝子を入れる場合がある。 また、突然変異で本来の酵素が耐性になる場合もある。この場合は、遺伝子組換えでは無いので、使われ方は同様であっても、規制は無い。実際、ナタネやコムギでは変異による除草剤耐性が使われている。 当然、一定の確率で除草剤に耐性となる雑草の出現は考えられるし、実際に報告もある。 詳細な調査は無いが、耐性雑草は、遺伝子フローではなく、突然変異と考えられる。 芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン） Aromatic amino acide 芳香族アミノ酸 芳香族アミノ酸 枯死 生育 植物にとって必要 非組換植物（野生型）WT 遺伝子組換え植物 GMO

40 害虫抵抗性作物 insect rtesistance
Mainly maize, cotton 非組換え 遺伝子組換え Btタンパク質を生産 トウモロコシではアワノメイガによる被害が深刻。 害虫抵抗性作物とは殆どがBtタンパク質を発現させた作物。 写真の上は非組換え体でアワノメイガの被害により結実が十分出ない。組換え体では被害が見られない。これは顕著な例。 Btタンパク質は、微生物（ Bacillus thuringiensis ）が生産するタンパク質で、カイコの病気の原因として古くから研究されている。 種特異性が強く、現在もっとも普及しているものは、チョウやガの仲間に特異的とされる。 （写真は小泉（奈良先端大）提供） Btタンパク質 微生物(Bacillus thuringiensis)が作る殺虫性タンパク質 様々な種類があり、それぞれ特定の昆虫に効果がある 生物農薬として有機栽培にも40年以上使われている

41 アワノメイガによるトウモロコシの被害 トウモロコシの茎の断面 遺伝子組換え 非組換え アワノメイガ トウモロコシに被害をもたらす害虫
アワノメイガは幼虫が茎の内部を食い荒らすので、外部からの殺虫剤散布は殆ど効果が無い。 Bt製剤は生物農薬として長年（数十年）使用の歴史がある。有機栽培にも認められている。 もっとも生物農薬として用いられる場合のBtの量と比べると、Btトウモロコシなどかに由来するBtの量けたはずれに多いらしい（１万倍？）。 Btトウモロコシの花粉をまぶしたトウワタの葉を食べたオオカバマダラの幼虫が死んだというコーネル大の論文はNatureに掲載され大きな議論を呼んだ。 実験条件設定の不備の問題等が議論された結果、自然環境ではオオカバマダラの生育にBtトウモロコシは影響が無いということで落ち着いている。 Btタンパク質を食べると死ぬ 茎の内部にいるので殺虫剤は効果が無い 写真提供：日本モンサント

42 Btタンパク質の特異性 Mammal Insect 害虫 ヒトや家畜など 消化管に Btタンパク質の 受容体がある 胃で分解される 胃腸に
受容体がない 他のタンパク質 と同じように 消化される 消化管が 破壊される Btタンパク質はカイコの卒倒病の原因であり、日本でも研究の歴史は深い。 上の説明の補足：Btタンパク質は消化管で限定分解を受け、受容体に結合する。 この限定分解はアルカリ状態下で起こる。 昆虫の消化器官はアルカリ性なので限定分解が起こるが、ヒトなどは酸性でこの分解は起こらない。 （イラストはSTAFFの資料を改変） だいじょうぶ 死んでしまう

43 ウイルス抵抗性パパイヤ Virus resistance papaya
Papaya in hawaii： パイナップルに次ぐハワイの重要な農産物（果物） パパイヤリングスポットウイルス（PRSV） 世界中で問題 抵抗性品種が無い 1950年代からハワイで深刻化 ハワイでは当初オアフ島でパパイヤ栽培が行なわれていたが、１９４４年にPRSVが報告され、１９５０年代に深刻化。 １９６０年代、ハワイ島に生産拠点が移る。プナ地区で最も盛んに栽培。 １９７０年代にヒロ地区でPRSVが発見される。 プナ地区に蔓延すれば、ハワイのパパイヤ産業が壊滅的な打撃を受けることから、組換えによる抵抗性品種の作出が検討される。 資料（写真）は組換えパパイヤの開発者の１人ゴンザルベス博士提供（現ハワイ大学） 遺伝子組換え技術による抵抗性品種の作出

44 PRSV resistance papaya
　ウイルス遺伝子の解析、ベクター開発 抵抗性の原理：コートタンパク質の発現 （現在ではRNAiによる効果と判明） 　遺伝子導入法の確立 パーティクルガンにより導入 PRSVに耐性を持つ野生型のパパイヤは知られていない。そこで組換え技術の利用を検討。 ８０年代、ウイルスのコートタンパク質を発現させるとウイルスに耐性となるという研究が盛ん。 この場合も、同様のアプローチが取られた。現在ではRNAiの効果であろうと考えられている。 資料（写真）は組換えパパイヤの開発者の１人ゴンザルベス博士提供（現ハワイ大学） 1991　組換えパパイヤの完成 1992　圃場試験の開始

45 PRSV抵抗性パパイヤの実用化 1992年4月 圃場試験の開始（オアフ島） 1992年5月 プナ地区（ハワイ島）でPRSVが発見
1992年4月　圃場試験の開始（オアフ島） 1992年5月　プナ地区（ハワイ島）でPRSVが発見 1994年　　 プナ地区で被害が深刻化 1998年5月　実用化が承認 92年にオアフ島で圃場試験が始まったすぐ後に、プナ地区でウイルスが発見される。 94年ごろから被害は深刻化し、98年には生産は半分まで減少。 ９８年に実用化が承認される。この時は、パパイヤ農家に種子が無償で提供された。 資料（写真）は組換えパパイヤの開発者の１人ゴンザルベス博士提供（現ハワイ大学） 1992年　圃場試験 1994年　ハワイのパパイヤの危機

46 遺伝子組み換えパパイヤの現状 ハワイのパパイヤ生産はウイルス被害以前程度に回復 (Recovery)
ハワイの組換えパパイヤ栽培面積(GMO papaya)が77％超え（2011年） ハワイ市場では組換えも非組換えも区別無く販売されている 日本食品安全委員会　遺伝子組み換えパパイヤパパイヤの安全性を確認（2009年） 日本で遺伝子組み換えパパイヤの輸入開始 Import（2011年12月） 落ち込んでいた2000年から生産量は回復を始め、現在ではウイルス被害以前まで回復。 2004年には半分以上が組換えパパイヤ。米国では表示義務が無いので、普通にスーパーで売られている。 殆どの消費者は組換えかどうかを気にしていない。 価格は組換えか非組換えかで違わない。 日本での食品としての承認をしていないが、2006年初めに食品安全委員会で検討が始まった。 資料（写真）は組換えパパイヤの開発者の１人ゴンザルベス博士提供（現ハワイ大学） 右の写真は小泉（奈良先端大）提供。 タイにも技術移転が行なわれ、圃場試験が行われているが、組換えパパイヤが流出し、問題となっている。 パパイヤ農場の様子 Kapoho（non GMO）とRainbow（GMO）

47

48 Next GMO For global and human benefit
Health, nutrition, taste, quality・・・ Non-food (flower, medical, environmental) →　乾燥耐性トウモロコシ drought-tolerant maize （cold shock protein =RNAシャペロンの利用） Monsant社　 Droughｔ-Gard 乾燥状況下でも安定収量を期待　 2013年3月商用生産開始（米国）

49 Golden rice for vitamine-A supply 世界のビタミンA欠乏（1996年）
公衆衛生の重要度 欠乏 重度潜伏性 中度潜伏性 軽度潜伏性 制御されている データ未入手 一人あたりの摂取カロリー が2700Kcal以下 ビタミンA欠乏は、開発途上国に暮らす5歳未満児の40％に対し、免疫機能の低下を引き起こしている。 これは、年間100万人の子どもの死の原因となっている。ユニセフと微少栄養素イニシアチブの報告（2004年） WHO（世界保健機構）によれば年間２５万から５０万人の子供が失明している。 主に、アフリカ、南アジアで問題が深刻。 これらの国の多くではコメが主食あるいはコメの栽培は可能。 水域 出典：世界食糧機構（FAO）

50 カロテノイド生合成とゴールデンライス Normal rice Form maize rice native
イネはβカロテンを合成できるが、可食部（胚乳）にはβカロテンが蓄積しない。 最初に作られたゴールデンライスではラッパ水仙(Narcissus psuedonarcissus)のphytoene synthase と土壌細菌（Erwinia uredovora）のcarotene desaturase を導入 ２０１３/１４年商用栽培開始予定（フィリピン）だったが、妨害破壊活動により遅れ Nature Biotechnology (2005)から引用

51 青色いバラの作出 → 2009年１１月市販化 Host transgenic rose （common variety)
青色いバラの作出　→　2009年１１月市販化 青色色素 “デルフィニジン”を作るために、パンジーから取り出したF3'5'H遺伝子を導入。 その結果、花弁のデルフィニジン含量がほぼ100%のバラの開発に成功。サントリーとフロリジン社との共同開発。 しかし、組換えバラは、紫に見えて青とは言いにくい。 花の色を決定する要因は色素の種類に加えて液胞pH、金属鎖体．コピグメンテーションなどが影響する。 いずれも現在の遺伝子組換え技術では制御が難しい。 SUNTORY blue rose APPLAUSE(アプローズ) Host （common variety) transgenic rose 写真提供：サントリー（株）

52 液胞にアントシアニン系の色素がたまるといっても葉では葉肉細胞（柔組織）、花では表皮細胞の液胞が着色。
（アサガオの場合は表皮細胞） （カエデの場合は葉肉細胞） （Vacuoles in Mesophyll cells in leaves） （Vacuoles in epidermis in flowers） 液胞にアントシアニン系の色素がたまるといっても葉では葉肉細胞（柔組織）、花では表皮細胞の液胞が着色。

53 花の色と色素 Flower color and pigments アントシアニンは花の色を決定する主要色素の1つ
(anthocyanin is one of pigments for flower color) ← anthocyanin 　　→ 青色色素であるデルフィニジンはバラ、キク、カーネーションには無い Cyanidin Pelargonidin Delphinidin

54 生合成経路（Synthetic pathway)
Phenylalanine バラで欠損 Lack in rose アントシアニンを含むフラボノイドの生合成は詳細に研究されている。 その経路は少なくとも高等植物では共通で、図に示した酵素の遺伝子はすべてクローニングされている。 F３’Hはフラボノイド-3’ -ヒドロキシラーゼ、 F3’5’H:フラボノイド3’5’-ヒドロキシラーゼ　DFR:ジヒドロフラボノール4-リダクターゼ F３’HやF3’5’Hの酵素の強さにより、蓄積する色素の量が変わり、花の色も変化する。 Cyanidin Pelargonidin Delphinidin

55 白いカーネションにペチュニアの２つの遺伝子を導入 Petunia genes for carnation
First blue carnation 白いカーネションにペチュニアの２つの遺伝子を導入 Petunia genes for carnation Petunia Petunia Pansy genes in case of rose サントリーが商品化した青いカーネーション（ムーダスト）。 ペチュニアのF3’5’H:フラボノイド3’5’-ヒドロキシラーゼとDFR:ジヒドロフラボノール4-リダクターゼを導入。 デルフィニジン 写真提供：サントリー（株）

56 放射能と放射性物質 (Radio isotope)
放射性セシウム（137Cs:半減期30.1年、134Cs:半減期2.1年）がもっとも問題 　（I-131は半減期5日、Sr-90とSｒ-89は放射能比でセシウムの１％未満） 2012年3月16日時点

57 放射性セシウム radio-active Cs
Ｃｓ降下量　福島事故で東京では（2011年３～５月累計） In Tokyo　 　　17318 Bq/m2 （文部科学省発表）　　　　　　 Beforeは・・・ 岡山の2011年３～５月降下量は8.9 Bq/m2 (Okayama)

58 放射性セシウムの直接汚染と間接汚染 福島県果樹試験場のモモへの直接汚染 （2011年6月の測定例）
Direct 直接汚染（放射性降下物の葉などへの吸着）：　原発事故直後 In direct 間接汚染（根からの吸収）：　現在 福島県果樹試験場のモモへの直接汚染　（2011年6月の測定例）　　 　「遺伝」誌　2012年1月号より

59 Direct Indirect Cs+ Cs+ Cs+ どうやって除去するか Cs+ (how to remove) どうやって入るか
（どうしたら入らないようにできるか） How to prevent the entrance/influx

60 放射能、放射線について ベクレルとシーベルト(Bq, Sv) 自然放射線 (natural irradiation) 規制値(limit)
植物のCs取り込み 植物を使った土壌Cs除去の可能性 （ファイトレメディエーション） Cs+ Cs+ どうやって除去するか Cs+ どうやって入るか （どうしたら入らないようにできるか）

61 Bq（ベクレル）とSv（シーベルト） Bq: ベクレル （becquerek) 放射能の量を表す単位
放射能の量を表す単位　 1秒間に放射性核種が１個崩壊するのが１Bq Sv:　シーベルト　（sievert) 被曝による生物学的影響の大きさの単位 1Gy（吸収線量）に放射線ごとの線量当量＊をかけたもの 　＊放射線ごとにことなる係数　（α線２０、x線、ガンマ線、β線は１） mSv/h →　ｘ24x365(=8760) /1000 →　mSv(/year) 実効線量係数　1Bｑ　＝　10-9～10-7 Sv　（核種による） 　　　　　　　　　　　　　　　　(0.001～0.1mSv) 137Cs　→　137mBa　→　137Ba　(主要経路) β　 γ 半減期　30.1年　　　2.55分 Csの実効線量係数 6.7ｘ10-9　Sv/Bq　(吸入摂取） 1.3ｘ10-8　Sv/Bq　(経口摂取）

62 自然放射線 natural irradiation
外部（宇宙線、地殻、空気）約1.5mSv/年（日本平均）、約2.4mSv/年（世界平均） 　　航空機での飛行（東京-NY片道）：約0.1mSv増加 　　医療被曝（1回）： CTで6.9mSv、胃のX線検査で0.6–2.7mSv付加 内部（40K　14C）　約0.3mSv/年　（ 40Kが約4000Bq、 14Cが約2500Bq) カリウムは動植物の必須ミネラル　カリウム全体の1/10,000くらいある天然放射性物質 食物での40K（例：ジャガイモ　400Bq/Kg）→人体へ 人体　約60Bq/Kg　　体重67kgで約4000Bqを内部にもつことになる 規制値は、メリットデメリットおよび自然放射線量との関連で考える

63 規制値 リスク コスト これはCsについての値である （ 40Kや14Cとは別枠）
ガンマ線スペクトルの実例 Measurement sample of Cs 15Bq/kg rice 規制値　リスク　コスト 食品新基準値（２０１２年４月１日から適用） 「一般食品」 food 　　　　 100 Bq/Kg、 「乳児用食品」と「牛乳」　　 　50 Bq/Kg 「飲料水」 　　　 　10 Bq/Kg これはCsについての値である （ 40Kや14Cとは別枠） (for Cs, but not consider 40K, 14C) 注目： 先に示した天然40Kより相当少ない （普通の食品の平均以下） Cs15Bq/kg程度のサンプル玄米の測定例 （町田放射能能市民測定室のデータ）

64 規制値 リスク コスト 除染基準 5mSv? 1mSv? 5mSv → 1mSv で除染コストは数兆円↑ 晩発性放射線障害（ガン）
規制値　リスク　コスト 食品新基準値（２０１２年４月１日から適用） 「一般食品」 　　　　 100 Bq/Kg、 「乳児用食品」と「牛乳」　　 　50 Bq/Kg 「飲料水」 　　　 　10 Bq/Kg 　（経口で）　 Cs 1mSv/年 = 7.7 x 104Bq/年 　　= 770 Kg/年 (一般食品) 　　　　　　　　　（2.1 kg/日） 除染基準 5mSv? 1mSv? 5mSv　→ 1mSv　で除染コストは数兆円↑ ガンで死ぬリスク（30％）をリスク１とする ＜急性障害は別＞ 「遺伝」誌　2012年1月号より

65 食用作物のCs吸収量を減らす Reduce Cs in eatable parts
原発事故から5年以上が経過した現在： 問題となる土壌のCsはほとんどが土壌に強く保持されたもの 「土壌-植物系での放射性セシウムの挙動とその変動要因」 （農業環境技術研究所報告31号2012年）参照 　→　物理的方法での除去が困難 完全に出てこなければ、植物への吸収は問題にならないが・・・ 　　 空中線量への影響を考えると除去しないわけにはいかない 植物は、土壌に強く結びついたCsもある程度吸収できる（できてしまう） 植物（栽培）側からの対策は・・・・ 食用作物のCs吸収量を減らす Reduce Cs in eatable parts Csをよく吸収できる植物（非食用）をつかってCsを除去 Remove Cs using non-crop plants

66 植物のCs取り込み 移行係数(transfer coefficient )： 土壌Csのどのくらいが植物に移行するか
イネ玄米の場合・・・ ～0.012 （rice） Cs+ 土壌のCsを完全に除去する必要はない イネ作の制限値は5000Bq/Kg Soil　（土壌） Cs+ Cs+

67 どうやって入るか How Cs enters into plant cerlls
どうしたら入らないようにできるか 植物のCs吸収量 K施肥量 カリウム（K)を施肥するとCsの吸収が減るとされている 競合関係 K+が少ない時は、高親和性K+輸送体（低濃度のK+を取り込むことができるK+吸収のためのタンパク質）が働いて、Csはその仕組みを使って植物内に侵入すると考えられた(イネの場合） 実はほとんどがイネによる実験のデータをもとに議論 ・・・ いろいろな植物で調べると、全体としては・・・ Cs　K　Naの体内濃度の相関が見られない場合も多い （渡辺ら　植物生理学会２０１２年年会要旨集S11-5) K施肥によるCsの吸収抑制はある程度効果はある （万能ではない）

68 植物細胞 → Csを通す、通さない、さまざまな報告 研究継続中
カリウムの同族元素（２周下）だがカリウム輸送体だけで取り込まれるのではないらしい カリウム輸送体（特異的、選択的） 植物細胞 K+ (Cs+) K+ Na+ Cs+ Ca2+・・・ 陽イオン非選択的輸送体 →　Csを通す、通さない、さまざまな報告　　研究継続中

69 Study of Cs transporters　→　Breeding less Cs-uptake crops
How to do？？ 遺伝子組み換え（GMO)？？？ 品種選抜技術 (Selection) 施肥/水管理技術 (fertilization and water manaziments) 化学物質 (chemicals) ・・・・

70 ファイトレメディエーション(Phytoremediation)：
植物が水分や養分を吸収する能力を利用して、汚染物質を吸収、分解する技術 Cs+ Cs+ Cs+ 植物を使った土壌Cs除去の可能性 残された課題： 　　Cs高蓄積でバイオマスの大きな植物がない 　　もしあっても、その植物をどのように処分するかが不透明

71 NEXT CLASS (Last Class): July 27
Dr. Shibasaka 柴坂先生