LC/MSを用いた生物試料中の ジラム、マンゼブの定量

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1 LC/MSを用いた生物試料中の ジラム、マンゼブの定量
株式会社住化分析センター ○木村　義孝、村上 雅志、竹田 菊男

2 ジラム 構造 物性 分子量 融点 (℃) 蒸気圧 (mPa) 水溶解度 (mg/L) LogPow 305.83 250～251.5
< 1 (25℃) (20℃) 1.23

3 マンゼブ 構造 物性 分子量 融点 (℃) 蒸気圧 (mPa) 水溶解度 (mg/L) LogPow 270.53 192～194 極小
(20℃) 不溶 1.20

4 分析上のポイント ジチオカルバメート系農薬は、金属錯体のままではほとんどの溶媒に溶けない
対象物質をアルカリ性EDTA溶液でナトリウム塩に変換して可溶化 ヨウ化メチルでメチルエステル化 ジラムはジメチルジチオカルバミン酸メチル(DMDTC-Me)として分析 マンゼブはエチレンジチオカルバミン酸ジメチル(EBDTC-2Me)として分析

5 分析上の注意点 ジメチルジチオカルバミン酸及びエチレンジチオカルバミン酸を構造に持つ物質の分別定量ができない
　　　　　　ジラム換算合量及びマンゼブ換算合量 DMDTC-Me (ジラムの誘導体化物)を生成する物質：　 　　　　チウラム、有機ニッケル等 EBDTC-2Me (マンゼブの誘導体化物)を生成する物質：　 　　　　ジネブ、マンネブ、アンバム、ポリカーバメート等

6 Sep-Pak Plus C18 + Sep-Pak Plus Alumina N
ジラム、マンゼブ（生物） 分析フローチャート ×2 生物試料 10 g ホモジナイズ 振とう 遠心分離 ジクロロメタン 10 mL + 5% L-システイン-5% EDTA溶液 25 mL ホモジナイズ5分 30分 3000rpm 5分 pH調整 メチル化・抽出×2 濃縮・転溶 0.4 mol/L TBA溶液 5 mL 2 mol/L塩酸、pH7.5～7.7 0.1 mol/Lヨウ化メチル含有 アセトン/ヘキサン(1:2) 50 mL 約2 mLまで濃縮 アセトニトリル転溶、 クリーンアップ 濃縮 LC/MS-SIM Sep-Pak Plus C18 + Sep-Pak Plus Alumina N 負荷、アセトニトリル 1 mLで洗浄負荷 アセトニトリル 7 mL + 25 mLで溶出 約0.5 mLまで 精製水で1.0 mLに 定容 ジラム：Pos+ マンゼブ：Neg-

7 分析条件（LC） LC 機種 Agilent 1100 LC カラム SUMIPAX ODS K-03-2015
（2 mm×150 mm, 3 µm） 移動相 A:0.1%ギ酸　　B:アセトニトリル 0→20 min A:70%→5% 　B:30%→95%　Linear gradient 流量 0.2 mL/min カラム温度 30℃ 注入量 20 µL

8 分析条件（ＭＳ） MS 機種 Agilent 1100 MSD SL キャピラリー電圧（Vcap) 3000 V ネブライザー
N2（50 psi） ドライングガス流量及び温度 N2（10.0 L/min, 320℃） イオン化法 ESI-SIM ジラム：Pos+, マンゼブ：Neg- モニターイオン ジラム　　136/138 マンゼブ 239/191

9 標準物質測定クロマトグラム 標準物質測定クロマトグラム ジラム(定量イオン)： 2 ng ジラム(確認イオン)
min 8 10 12 14 16 18 2000 4000 6000 ジラム(定量イオン)： 2 ng ジラム(確認イオン) マンゼブ(定量イオン)： 0.2 ng マンゼブ(確認イオン) 標準物質測定クロマトグラム

10 LC/MS測定条件の検討 測定モードと感度 (単位：pg、約S/N=3) APCIモードでは、ベースラインの異常上昇及び感度変動などが顕著
　　　→ ESIモードでの測定 ESI-Positive モードでは、マンゼブ定量イオン(m/z 241)のベースラインが上昇 　　　→ ジラムはESI-Positiveモード、 　　　　　マンゼブはESI-Negativeモードで測定 測定モード APCI ESI Positive Negative ジラム 100 - マンゼブ 10

11 ホモジナイズ後抽出方法の検討 既報における問題点 クロロホルム/ヘキサン(3:1)によるメチル化・抽出
　→ LC/MSでの測定においてイオン源に白い粉末や油状の物質が付着 　　　　→ ベースラインの著しい変動や感度の低下 　→ 生物試料を使用しない前処理操作でも低い回収率 抽出溶剤変更の検討 　　ジクロロメタン/ヘキサン(3:1)、ヘキサン 　　　　　　　　　　　　　　及び　　アセトン/ヘキサン(1:2)　採用 市販のDMDTC-Me及びEBDTC-2Me (林純薬工業株式会社)の測定結果 　　　　　→ DMDTC-Me：66.8%、EBDTC-2Me：69.4%

12 濃縮方法の検討 エバポレーター濃縮による回収率の低下 防止策 回収率の改善 ジラム： 揮散 マンゼブ： 分解
ジラム： 揮散 マンゼブ： 分解 防止策 酸化防止剤：1% L-システイン含有メタノール添加 濃縮は約2 mLまでとし、乾固を避ける 　　　　　　　　　　 回収率の改善

13 検量線の作製方法 本法の誘導体化効率(回収率) ジラム： 66.8% マンゼブ： 69.4% 検量線用の標準溶液 試料と同様の操作を行い調整

14 検量線 ジラム(0.2～20 ng) マンゼブ(0.02～2 ng) Amount[ng] 10 Area 50000 100000
10 Area 50000 100000 150000 200000 250000 1 2 3 4 5 6 7 DMDTC-Me, MSD1 136 Correlation: Area = *Amt +0 Amount[ng] 1 Area 20000 40000 60000 80000 100000 120000 2 3 4 5 6 7 EBDTC-2Me, MSD2 239 Correlation: Area = *Amt +0 ジラム(0.2～20 ng) マンゼブ(0.02～2 ng)

15 IDL、MDL IDL MDL 成分 ジラム マンゼブ 試料量 (g) 10 最終液量 (mL) 1 注入液濃度 (µg/L) 25 2.5 装置注入量 (µL) 20 IDL (ng) 0.064 0.0072 IDL (µg/kg) 0.32 0.036 成分 ジラム マンゼブ 試料量 (g) 10 最終液量 (mL) 1 注入液濃度 (µg/L) 25 2.5 装置注入量 (µL) 20 MDL (µg/kg) 0.53 0.074 MQL (µg/kg) 1.37 0.191

16 操作ブランク、添加回収試験 操作ブランク 60 添加回収試験（カレイ） 80 67 106 検出せず ジラム 10 25 7 1.51
物質名 試料量 (g) 添加量 (ng) 測定回数 検出濃度 (µg/kg) 回収率 (%) 変動係数 ジラム 10 25 7 1.51 60 9.1 150 3 12.0 80 6.3 マンゼブ 2.5 0.168 67 11.4 15 1.58 106 8.3

17 環境試料分析例 カレイ測定クロマトグラム ジラム(定量イオン)：不検出 ジラム(確認イオン) マンゼブ(定量イオン)：不検出
min 8 10 12 14 16 18 500 1000 1500 ジラム(定量イオン)：不検出 ジラム(確認イオン) マンゼブ(定量イオン)：不検出 マンゼブ(確認イオン) カレイ測定クロマトグラム

18 環境試料分析例 添加回収試験クロマトグラム（カレイ） ジラム(定量イオン)：試料濃度 15 µg/kg ジラム(確認イオン)
min 8 10 12 14 16 18 250 500 750 1000 MSD1 136, EIC=135.7:136.7 API-ES, Pos, SIM, Frag: 90 MSD1 138, EIC=137.7:138.7 API-ES, Pos, SIM, Frag: 90 MSD2 239, EIC=238.7:239.7 API-ES, Neg, SIM, Frag: Var MSD2 191, EIC=190.7:191.7 API-ES, Neg, SIM, Frag: Var ジラム(定量イオン)：試料濃度 15 µg/kg ジラム(確認イオン) マンゼブ(定量イオン)：試料濃度 1.5 µg/kg マンゼブ(確認イオン) 添加回収試験クロマトグラム（カレイ）

19 まとめ 本法により、生物試料中ジラム1 μg/kgレベルおよびマンゼブ0.1 μg/kgレベルの定量が可能である。
なお本検討の内容は、環境省より委託された「平成17年度化学物質環境実態調査暴露量調査(生物)分析調査」によるものである。