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遺伝子の解析 第2弾 DNAシークエンス法
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DNAシークエンス （ABI PRISM３１０を用いて遺伝子の配列を読む）
ABI PRISM３１０でのシークエンス反応はサイクルシークエンス法とよばれる方法で行っています。まず、PCR反応でA,G,C,Tそれぞれに、励起する波長が異なる４種類の蛍光色素をｄｄNTPにつける方法（Dye Terminator法）を用い、その標識されたDNAフラグメントを内径５０μｍのキャピラリー管のなかで電気泳動を行いA,G,C,Tそれぞれの蛍光をCCDカメラで検出し、塩基配列を読むことができます。 原理 オートシークエンサー（ABI PRISM３１０）の反応では合成 されるDNAを蛍光物質で標識します。 その標識されたDNAを電気泳動し、泳動中にレーザー光を当て励起光を自動で検出し、コンピューターで解析します。
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～DNAシークエンスの流れ～ PCRにて目的のDNA量を増やす。（同時に蛍光標識も行う） エタノール沈殿にて目的DNAの分離・精製
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デオキシヌクレオチド（ｄNTP）と ジデオキシヌクレオチド（ｄｄNTP） Ｐ Ｐ OH H 塩基 塩基 デオキシヌクレオチド（dNTP）
ジデオキシヌクレオチド（ddNTP） dNTPとddNTPはPCR法でそれぞれDNAの構成単位として利用されます。違いは３´の位置の水酸基が水素基になっていることです。NにはA,T,G,Cの4種類の塩基が当てはまります。
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dNTPとddNTPの伸長反応の違い 伸長反応はStop OH OH dATPが 反応した場合 続く H ddATPが 反応した場合
５´末端 ３´末端 A T Ｇ Ｃ Ｐ OH ３´末端 T Ｇ Ｃ A Ｐ OH ５´末端 続く dATPが 反応した場合 ３´末端 T Ｇ Ｃ A Ｐ H ５´末端 ddATPが 反応した場合 伸長反応はStop
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dNTPとddNTPが一緒にあるときにPCR反応をすると・・・・
dNTPをA,T,G,Cとし、ddNTPをA*,T*,G*,C*とする A* TGCATGC ５´ ３´ テンプレートDNA ACG* TGCATGC ５´ ３´ ACGTACG TGCATGC ５´ ３´ ACGTACG* TGCATGC ５´ ３´ PCR反応 ACGT* TGCATGC ５´ ３´ A*,T*,G*,C*が取り込まれると、そこで伸長反応が停止するのでいろいろな長さ（分子量）のDNA断片が作られる
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Dye Terminator法 Ｐ 塩基 H 蛍光色素 ddNTPの４種類の塩基（A,T,G,C）それぞれに異なった蛍光色素を標識することで4種類のddNTPを見分けることができる。 A T G C P H P H P H P H
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蛍光色素で標識することで・・・・・ ほぼ同じ長さ（分子量）だが これら４種類のDNAを 区別することができる ACA* TGTATGC
ACC* TGGATGC ５´ ３´ ACG* TGCATGC ACA* TGTATGC ACT* TGAATGC ほぼ同じ長さ（分子量）だが これら４種類のDNAを 区別することができる
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ゲル電気泳動の分子ふるい効果 DNAは負電荷を持つ高分子なので全て＋極へ進みます。DNAの分子量が小さいほど（短いほど）ゲルマトリックスとのふるわれ方が少なく、進みやすくなります。このように一定時間泳動すると分子量の差によってDNAが分離されることを分子ふるい効果といいます。 － ＋ ゲルマトリックス 高分子DNA 低分子DNA
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Ex)塩基配列を知りたい（水色部分が知りたい部分）DNA
ACGTACG TGCATGC ５´ ３´ Dye Terminator法を利用してPCRをすると A* TGCATGC ５´ ３´ ACG* ACGT* AC* ACGTA* ACGTAC* ACGTACG* 出来上がったDNA断片 プライマー
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PCRで作られたDNA断片をポリマーを充填した（ゲルと同様）キャピラリー管の中で電気泳動をすると
５´ ACG* ACGT* AC* ACGTA* ACGTAC* ACGTACG* － ＋ 分子ふるい効果 により短い断片 が早く＋極側へ 移動する
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よって知りたかった塩基配列はACGTACGとなる
蛍光のついた塩基を早く＋極側についた順に並べると ACGTACG ACGTACG ５´ TGCATGC ３´ ５´ よって知りたかった塩基配列はACGTACGとなる 参考文献 改訂遺伝子工学実験ノート 羊土社 バイオ実験超基本Q&A 羊土社
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実際のシークエンス結果（一部抜粋）
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