土壌水 根 カスパリー線 道管 シンプラスト経路 アポプラスト経路 Apoplast Soil water Symplast Root

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1 土壌水 根 カスパリー線 道管 シンプラスト経路 アポプラスト経路 Apoplast Soil water Symplast Root
Casparian stripe 道管 xylem シンプラスト経路 Symplast アポプラスト経路 Apoplast 細胞間連絡　(plasmodesmata) 通常は分子量１０００以下 の物質が通過

2 東京農工大学生物生産科学フロンティアⅣ 2010/06/04
東京農工大学生物生産科学フロンティアⅣ　2010/06/04 Casparian Strip Symplast： Solutes MUST go into the cell 細胞（シンプラスト）に入るには問題が・・・・ 　細胞をつつむ「膜」の基本組成は脂質（油っぽい） 　「水と油」だから、水の透過性は、ほどほど・・・ ドウヤッテ　 ハイロウカ？ H2O Lipids 実際の細胞はとてもよく水を透過させることが多い。

3 Water uptake（movement/flux）：
水ポテンシャル 細胞レベルでは アクアポリンはここに関係（後述） Water uptake（movement/flux）： Water flux*＝(駆動力）×（水の動きやすさ：透過性） Driving force water permeability （*per unit time） 水ポテンシャル差 Water potential difference

4 Molecular transport of water ・・・ depends on water potential deference
“Water potential” mainly consists in “concentration” and “presser” 物理的圧力（静水圧）: 「Presser potential」ψp 押しとどめるために必要な圧力（P) 膨張しようとする (Swelling) M ・・・「osmotic presser」 　　（proposal to concentration） Water molecule 「浸透圧」にマイナスをつけたもの⇒　「Osmotic potentail」ψosm minus (osmotic pressure) 「Semi-permeable membrane」 半透膜　Water can pass but solute (M) cannnot. Why minuis？　　ψp＋ψosm＝０　（釣り合っている場合）

5 植物細胞では、これが 「膨圧」Turgor
ψ1 ψ2 ψ1 ψ2 ψ1 ψ2 P P P ψosm: -0.1 > -0.5 (MPa) ψp: 0 < 0.4 (MPa) ψosm -0.1 > -0.5 ψp 0 < 0.4 ψ = -0.1 (ψ1 = ψ2) + Water movement Water moves from high ψw to low ψw Water potential ψw = ψosm + ψp + ・・・ 植物細胞では、これが 「膨圧」Turgor 1 MPa ≈ 0.4 mol/litter ≈ 10 atm （気圧）

6 動物細胞 植物細胞 Animal cells Plant cells 細胞膜 Plasma-membrane 細胞壁 Cell wall
(View from water potential) 動物細胞 Animal cells 植物細胞 Plant cells 細胞膜 Plasma-membrane 細胞壁 Cell wall Inner ψosm = Outer ψosm Inner ψw = Outer ψw Inner ψosm ≠ Outer ψosm Presser at call wall Inner ψw = Outer ψw

7 ψw ψw 土壌水分が足りない場合（乾燥地、塩ストレス）
At low water potential of soil (drought/ salt stress) 水ポテンシャル －　0　純水 Wet Soil Root Weak drought/salt stress soil Root Strong drought/salt stress soil Root ψw 水ポテンシャル soil Root Soil root ψw 細胞液の水ポテンシャルを下げる（浸透圧を上げる）

8 細胞質：糖、アミノ酸、有機物質 液胞：無機イオン K+ (Na+ 塩生植物） Cl- その他
細胞の水ポテンシャルを下げる（浸透圧を上げる）には・・・ 細胞質：糖、アミノ酸、有機物質 細胞外（土壌）水環境 核 液胞：無機イオン 　K+ 　(Na+　塩生植物） Cl- 　　　　その他 （細胞質には、ほぼ一定量（150mMくらい）のK+あり） 乾燥 塩ストレス

9 細胞質に蓄積される 特殊な有機物質 → H3N+- → (CH3)3N+-
特殊な有機物質　→ 適合溶質（compatible solute）とよばれる 浸透圧を上げる シャペロン活性 スカベンジャー活性 ベタインとは、本来はアミノ酸のアミノ基に3つのメチル基が付いた化合物の総称。 H3N+- →　(CH3)3N+- もっとも存在量の多いグリシンベタイン（＝トリメチルグリシン）を、単にベタインと呼ぶことも多い。

10 タバコ葉の例 （プロリン蓄積） グリシンベタインの合成系 塩ストレス誘導性 イネでは通常は基質不足 左： 150 mM NaCl 右： 150 mM NaCl + 5mM betaine aldelyde

11 水ポテンシャル差 Water potential difference
アクアポリンの機能・構造 水ポテンシャル差 Water potential difference Water flux*＝(駆動力）×（水の動きやすさ：透過性） Driving force water permeability （*per unit time） 表面積×面積当たりの水透過性 Surface area 　water permeability per unit area 　　 Aquaporin determins this

12 H2O Before discovery of aquaporins （アクアポリン発見前）？ 液胞膜 Tonoplast
原形質膜（細胞膜） Plasma-membraene After all, the message that appeared in textbooks was that water simply diffused "somehow'' across plants membrane and proteins were not involved in these processes. Biophysicists continued to use pore models to explain membrane permeations without seeking a molecular explanation. A.R.Schaffner Planta 204: (1998)

13 Novel prize (Chemistry) "for the discovery of water channels"
Prof. Peter Agre Novel prize (Chemistry) "for the discovery of water channels" アグリ博士の貢献：92年のScience論文と、２００３年ノーベル賞

14 Aquaporin（アクアポリン） （機能） 細胞の水透過性 脂質二重層より 高い 「水チャネル」の存在 が示唆される （タンパク）
　　　（機能） 細胞の水透過性 脂質二重層より 高い 「水チャネル」の存在 が示唆される (water channels suggested) 　　（タンパク） 生体膜に多量に存在する機能不明の膜タンパク 　CHIP28 　PM28 　　　（遺伝子） Major Intrinsic Protein (MIP) 　水晶体のレンズ 大腸菌のグリセロール輸送体 （GlpF) アクアポリン発見までの状況と流れ Aquaporin（アクアポリン）

15 水チャネル アクアポリン Aquaporin 植物の生育期間を通じて水の吸収と蒸散量は生重量の１００倍 代謝と成長に使われるのは、約５％
　植物の生育期間を通じて水の吸収と蒸散量は生重量の１００倍　 　代謝と成長に使われるのは、約５％ 　水輸送は、もっとも大量の膜輸送である。 →　その分子基盤がアクアポリン Aquaporins as molecular basis H2O H2O 生体膜 membranes 水チャネル アクアポリン Aquaporin 10～100-hold higher water permeabiliyu with aqauporins

16 東京農工大学生物生産科学フロンティアⅣ 2010/06/04
東京農工大学生物生産科学フロンティアⅣ　2010/06/04 アクアポリンの機能（水透過）の活性調節に関わるアミノ酸残基（植物の場合） Regulatory regions Structure in the membrane 細胞がアクアポリンを持つことは、単に水透過性を高くするということではなく、透過性を制御できる、という点で大きな意味がある。 Aquaporins ; 1) increase membrane water permeability 2) make it possible to regulate water permeability Structural features 2 NPA motives 6 Trans-membrane helixes (TMHs) and 5 inter-TMH loops Phosphorylation targets

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東京農工大学生物生産科学フロンティアⅣ　2010/06/04 Top view of AQP1 (a) Ribbon diagram　(b)Space-filled one Side view of AQP1 (c) Ribbon diagram　(d)Space-filled one Murata at al. (2000)　Nature 407:599

18 東京農工大学生物生産科学フロンティアⅣ 2010/06/04
東京農工大学生物生産科学フロンティアⅣ　2010/06/04 ＮＨＫ　２００７年５月９日放送

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東京農工大学生物生産科学フロンティアⅣ　2010/06/04

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東京農工大学生物生産科学フロンティアⅣ　2010/06/04

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東京農工大学生物生産科学フロンティアⅣ　2010/06/04 ヒトアクアポリン　１３個のアクアポリン（AQP)遺伝子がある 皮膚のみずみずしさ　→　AQP3 カネボウ化粧品スキンケアブランド「suisai（スイサイ）」の高保湿クリーム「ヒアロインクリームAP」 同社の「アクアポリン（肌における“水の通り道”）研究」の成果を応用し、配合成分を強化した・・・ 原尿からの水の再吸収（腎臓） 　→　AQP2 EtOH → AVP↓ → Exocytosis ↓ → AQP in PM ↓ 涙　→　AQP5　（壊れるとドライアイ） 唾液　→　AQP5　（壊れると口腔乾燥症）

25 東京農工大学生物生産科学フロンティアⅣ 2010/06/04
東京農工大学生物生産科学フロンティアⅣ　2010/06/04 植物のアクアポリン (Plant aquaporins) Aquaporin = MIP (membrane intrinsic protein) PIP(plasm-membrane…) 　　（原形質膜型） TIP(tonoplast….) 　　（液胞膜型） NIP(Nodulin26-like…) SIP(small …) ER signaling? XIP(x …) XIPs are found in some plants (tomato, cotton, moss) but functions are not yet known シロイヌナズでは３５個のMIP　 (35 Major Intrinsic Protein in Arabidopsis) 　 (ヒトでは１３個(human)、微生物は１から２個(bacteria)) Why many in plants?

26 生育ステージ：発芽、成長、生殖、結実 環境変化：乾燥←→湿潤 局在(localization) 細胞膜（ＰＩＰ） 液胞膜（ＴＩＰ）
Regulation by; humiditiy、salt stress、light、temeperature、others 局在(localization) 細胞膜（ＰＩＰ） 液胞膜（ＴＩＰ） 根粒菌包膜(NIP) ER膜(SIP?) 構造(structure) >30 genes 機能(function) substrates　 　　（H2O、CO2、B、Si・・・） 水輸送の重要性とその分子基盤としてのアクアポリン 構造、機能、局在の概略、環境との関連、アクアポリン研究で考えられるアウトプット Stress tolerance、growth regulation、Post-harvesting

27 東京農工大学生物生産科学フロンティアⅣ 2010/06/04
そもそも植物の膜輸送系遺伝子は多い 東京農工大学生物生産科学フロンティアⅣ　2010/06/04 シロイヌナズナでは ポンプ トランスポーター チャネル 208種類 559種類 101種類 （すべての膜系あわせて） 「植物の膜輸送システム」（秀潤社）より 動けない(no move) 環境適応性が高い (high adaptability) 再分化／再生能力 (regeneration)

28 Determining cell water permeability
細胞の水透過性をきめる Determining cell water permeability 細胞外（土壌）水環境 水透過性高い：細胞質の体積を維持 High permeability: maintain cytolasm 液胞 Vacuole （細胞体積の９０％以上） (More than 90% volume) Wet Dry Salt stress (variable) 核 細胞質（cytoplasm） Cell wall Plasma-mambrane

29 Other susbstrate for other NIPs
窒素固定にも関係？ (Tyerman et al.） 空中窒素 (air N2) Leguminos root cells マメ科植物の根の細胞 Peribacteroid membrane ペリバクテロイド膜 Nutrition 栄養　　 N2　→　NH3　 H2O　　 N-fixing bacteria 窒素固定菌 NOD26 （NIP-type aqauporin）　　 Other susbstrate for other NIPs Si(OH)4 /As(OH)4　［OsNIP2;1］， B(OH)3 ［ AtNIP5;1 ］

30 Rice aquaporins To be elucidated 11OsPIPs (3OsPIP1s and 8OsPIP2s)
個々の 機能 形質? 重複 Individual function Redundancy Phenotype To be elucidated 11OsPIPs　(3OsPIP1s and 8OsPIP2s) in rice plants (PCP 46:568 (2005))

31 アフリカツメガエル卵母細胞による Swelling assay
東京農工大学生物生産科学フロンティアⅣ　2010/06/04 水輸送活性測定 アフリカツメガエル卵母細胞による　Swelling assay アフリカツメガエル 卵母細胞 (oocyte) マイクロピペット cRNA アクアポリン タンパク発現　 膜ターゲティング H2O 外液を低張液に交換 卵に水を吸わせる・・・ 　　　　　　　　　吸水が早くなるか？

32 なぜアフリカツメガエルの卵を使うの？ アフリカツメガエルの卵に植物の遺伝子など外からRNAを注入すると、卵でRNAからタンパク質が合成される。内在性のタンパク質はほとんど発現していない。 卵は本来水の輸送活性が低いので、RNA注入で多くの水を吸収した場合、合成されたタンパク質に水を運ぶ働きがあることになる。 アフリカツメガエルは生命力が強く、飼育しやすい。また広く研究に使われており、入手が容易。

33 東京農工大学生物生産科学フロンティアⅣ 2010/06/04
東京農工大学生物生産科学フロンティアⅣ　2010/06/04 ←20秒毎の写真を高速（実際の約200倍の早さ）で再生したもの 多量の水が入り込んだため、卵が破裂し内容物が溶出している オオムギアクアポリン遺伝子の一つ HvPIP2;1-injected Negative control (water-injected) 破裂→ 水輸送活性あり！ アフリカツメガエル卵母細胞を使った異種遺伝子発現／機能解析系

34 Water permeability (in oocyte system)
(Barley PIPs) (Rice PIPs) Time (sec) Relative volume (Matsumoto et al. PCP 50:216 (2009)) OsPIP1　isoforms OsPIP2　isoforms HvPIP2;1 ～　2;5 （透過性） HvPIP1;1 ～　1;5 and neg. cont. (Horie et al. et al. PCP 52:663 (2011)) Low water transport activity of PIP1s in oocytes (apprentice) 抗HvPIP2;4抗体 抗HvPIP1s抗体 ┏ Immunofluoresence ┓ HvPIP2;4-injection HvPIP2;4 単独発現 HvPIP1;2-injection HvPIP1;2 PIP1は単独で膜へ移行しない No membrane localization PIP1s alone

35 (Katsuhara in preparation)
膜に行っていても活性のない場合も （透過性） HvNIPs and OsNIPs (Katsuhara in preparation) EGFP-OsNIP2;2 injection Bright field GFP fluorescence

36 構造・機能改変 Molecular engendering
Amino acid sequence alignment of the region containing E-loop and the 6th TMH of barley PIPs. いずれも　水輸送活性あり 254M in HvPIP2;4  254I in HvPIP2;3

37 Water transport activity can be artificially modulated
254M can transport water 254Y cannot transport water HvPIP2;4M254I enhanced water transport activity Water transport activity can be artificially modulated