Candida versatilis の degenerate RT-PCR

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1 Candida versatilis の degenerate RT-PCR
100bp Marker Sample 解析予定 2000bp Ca++ ATPase 1000bp Cu+ ATPase H+ ATPase 解析中 500bp 解析中

2 酵母細胞膜のKとNaの取り込みと排出に関係する輸送系
H+ Na+ K+ Nha1p(Na+/H+アンチポーター) ATP H+ Pma1p (H+ポンプ) pHin 6.8 pHout 3.0 Na+ Ena1p/Pmr2p(Na+ポンプ) ATP Pho89p (Pi/Na+コトランス ポーター) 酵母細胞が高濃度の食塩を含む環境におかれた場合、Naイオンは、ここに示したKイオン輸送系を介して流入する。通常、これらのKイオンチャネルはKイオンに対して特異性があるが、非常に高いNaイオン濃度の場合は、その特異性の壁を越えてしまうと言われている。 細胞内に高い濃度のNaイオンが存在すると、このイオンの高い細胞毒性により、細胞内生理代謝が阻害され、死滅する。この塩害における化学的影響を回避するためには、効率よくNaイオンを細胞外に排泄する必要がある。酵母細胞では、２つのNaイオン排泄経路が同定されている。 一つ目は、Naイオンプロトンアンチポーターであり、細胞内外で形成されているプロトン勾配を駆動力として、このタンパク質はプロトンが流入する方向と逆に、細胞外にNaイオンを排出できる。このプロトン勾配の形成にはプロトンポンプが関係している。耐塩性酵母では、プロトンポンプの遺伝子発現が塩濃度に依存して起こることも示されている。 二つ目は、Naポンプで、ATPの加水分解のエネルギーを利用して、細胞外にNaイオンを排出できる。耐塩性酵母ではNaポンプの関与は小さいとする研究成果も得られている。 Na+ PO43- Duk1p/Tok1p (K+チャネル) Trk1p/Trk2p (K+取り込み系) K+ 　　　　　　　NscIp (陽イオンチャネル) Original by H. Sychrova K+ H+ K+

3 耐塩性酵母Candida versatilisの細胞膜ATPaseの遺伝子解析
遺伝子名 Saccharomyces cerevisiae Zygosaccharomy-ces rouxii Candida versatilis Na+/H+ アンチポーター NHA1 ZrSOD2, ZrSOD22 CvNHA1 H+ポンプ PMA1 ZrPMA1 ? Na+(K+)ポンプ ENA1/PMR2 ZrENA1 Ca2+Mn2+ポンプ PMR1/SPF1 Cd2+Cu2+Fe2+ポンプ PCA1/CCC2 Mg2+(Al3+)ポンプ ALR1/ALR2 Zn2+ポンプ ZRT1/ZRT2 マルチドラッグポンプ PDR12/PDR5/YOR1

4 味噌醤油諸味での微生物数の変動 耐塩性乳酸菌や好塩性乳酸菌の 生育により諸味のpH低下 酸性を好む酵母生育
Bacillus 細菌 耐塩性乳酸菌 好塩性乳酸菌 Zygosaccharomyces rouxii Candida versatilis 醤油諸味中の微生物菌叢の変化 日数 耐塩性乳酸菌や好塩性乳酸菌の 生育により諸味のpH低下 酸性を好む酵母生育 Z. rouxii 増殖　→ 主発酵酵母 C. versatilis 増殖 → 後熟酵母 なぜ、２つの酵母種において増殖 時期が異なる？

5 酵母細胞での浸透圧調節 酵母細胞が希薄な水溶液に ある場合、細胞内に水が吸い 込まれ、浸透圧が生じるが、 表層に細胞壁があるので、 細胞はダメージを受けない。 酵母細胞が高濃度の塩分や 糖質を含む環境にある場合、 細胞内から水が流出し、生理 的応答がなければ、細胞壁 から細胞膜が外れる原形質 分離が生じる。また、細胞内 の物質が高濃度になり、代謝 環境が悪くなる。 酵母の場合、細胞外に塩分が 存在する場合、その濃度に 応答してグリセロールを合成、 蓄積して浸透圧差を中和する。 耐塩性酵母は、適合溶質の 合成能が強く、さらに高濃度で 蓄積できる。 グリセロール C3 グリセロール C4 エリスリトール C5 アラビトール C6 マンニトール パン酵母・酒酵母 食塩 味噌・醤油酵母 （耐塩性酵母）

6 酵母のホスホリパーゼB遺伝子 Saccharomyces cerevisiae PLB1, PLB2, PLB3, SPO (YMR008C, YMR006C, YOL011W, YNL012W) Torulaspora delbrueckii PLB1 Schizosaccharomyces pombe PLB1 Candida utilis PLB1 Kluyveromyces lactis PLB1 Zygosaccharomyces rouxii PLB1 Candida versatilis PLB1/PLB2 Candida albicans PLB1/PLB2 Glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor Secreated enzymes Peptide motifes related to a catalytic function : SGGGXRA(M/L) : GLSG(G/S) : D(S/G)G(E/L)XXXN

7 リン脂質分解酵素の反応様式 Phospholipases

8 酵母ホスホリパーゼBのアミノ酸アライメント

9 酵母・カビの PLBsの系統樹

10 γ-アミノ酪酸経路 クエン酸回路 グルタミン酸デカルボキシラーゼ（GDA） グルタミン酸 γ-アミノ酪酸（GABA) CO2 コハク酸
γアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ 　　　　　　　　2-オキソグルタル酸 　コハク酸セミアルデヒド 　　　NADP+ 　　　　　　　　　　　　　　コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ 　　　　NADPH 　　　　2-オキソグルタル酸 　　　　　　　　　　　 　 　CO2　　　　　 コハク酸 グルタミン酸デカルボキシラーゼ（GDA） GABase クエン酸回路

11 植物を利用してＧＡＢＡを生成させる方法 微生物等を利用してＧＡＢＡを生成させる 方法 原料（植物） 企業名、研究機関 米胚芽 オリザ油化㈱
　原料（植物） 企業名、研究機関 米胚芽 オリザ油化㈱ カボチャ ロッテ電子工業㈱ 玄米 前：中国農試、㈱ファンケル他 緑茶(ｷﾞｬﾊﾞﾛﾝ茶) 前：茶業試験場、㈱葉桐他 ケール、大麦若葉 ㈱東洋新薬 米糠 　(ﾊﾞｲｵﾘｱｸﾀｰ) 新潟県食品研究センター (片山食品が漬物に利用) アスパラガス ユニチカ 植物を利用してＧＡＢＡを生成させる方法 原　料(微生物) 　　　企業名、研究機関 乳酸菌 ㈱ヤクルト、㈱ファーマフーズ、 　　㈱大阪生物環境科学研究所　他 愛媛県工業技術センター(特許出願) 乳酸菌＋酵母 フジッコ㈱ テンペ菌 池田糖化工業㈱ 麹菌(カビ) 栃木県産業技術センター、㈱カザミ 酵母 食品総合研究所 クロレラ クロレラ工業㈱ アガリクス ヤエガキ醗酵技研（株） 納豆菌 ミツカン 微生物等を利用してＧＡＢＡを生成させる 方法