中性シイステインプロテアーゼブレオマイシン水解酵素は、脱イミノ化されたフィラグリンをアミノ酸へと分解するのに不可欠である

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1 中性シイステインプロテアーゼブレオマイシン水解酵素は、脱イミノ化されたフィラグリンをアミノ酸へと分解するのに不可欠である
The Journal of Biological Chemistry (2009) Neutral Cysteine Protease Bleomycin Hydrolase Is Essential for the Breakdown of Deiminated Filaggrin into Amino Acids 2014/10/6 U4 小松　俊之 中性シイステインプロテアーゼブレオマイシン水解酵素は、脱イミノ化されたフィラグリンをアミノ酸へと分解するのに不可欠である Yayoii Kamata, Aya Taniguchi, Mami Yamamoto, Junko Nomura, Kazuhiko Ishihara, Hidenori Takahara, Toshihiko Hibino and Atsushi Takeda　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

2 皮膚の構造

3 プロフィラグリンのプロセシング

4 NMFに関して

5 背景と目的 ①フィラグリンは様々なプロテアーゼによりアミノ酸に まで分解され、NMFとして機能するが、その詳細なメカニスムはまだ分かっていない。 ②Calpain1やCaspase14といった酵素は、フィラグリンの分解に関与していると考えられているが、どのような順序で作用するか分かっていない フィラグリンを分解しNMFを生成する最終段階を触媒する酵素の同定と、その他の酵素の作用する順序の解明を目的とする。

6 シトルリンアミノペプチダーゼ活性 ・ ・Cit-MCAを基質として用い、二層蛍光ザイモグラフィーによって酵素活性を調べた。 ・サンプルは、4℃の5%ポリアクリルアミドゲルに添加した。 ・AはPH6.0,　B,CはPH7.5,　1は新生ラットの表皮抽出物、2は6週齢ラットの腎臓の抽出物、3はラットのBH ・表皮抽出物は中性で強いシトルリンペプチダーゼ活性を示し、BH(ブレオマイシン水解酵素)も同様の活性を示す。

7 様々なアミノアシル-β-NAに対する酵素活性
・表皮抽出物中のシトルリンアミノペプチダーゼ活性を持つ酵素を用いて、様々なアミノアシル-β-NAに対する酵素活性を調べた。精製した酵素(0.1unit)、基質2mM。 ･値は独立して行った実験の平均。 ・Cit-β-NAが最も分解されやすく、Pro(P)は全く生成せず、GLU(E)もほとんど生成しなかった。

8 酵素のトリプシン処理１ ・表皮から抽出したシトルリンアミノペプチダーゼ活性をもつ酵素をトリプシンで処理し、逆相HPLCで調べた。 ・ペプチドは215nmのUVの吸光度によって検知された。

9 酵素のトリプシン処理2 ・HPLCで得られた6つのピークT1ーT6を解析 ・得られたT1ーT6のペプチドはBH中のペプチドの配列に対応する。
・表皮からこの酵素の精製の過程において、シトルリンアミノペプチダーゼ活性と、ブレオマイシンの加水分解の活性が同時に見られる。 ・これらから、BHとこの酵素はどういつであると結論できる。

10 フィラグリンとBHの局在 ・人の皮膚を蛍光免疫染色した。核はDAPIで染色した。
･Aは核、BはBH、Cはフィラグリン、DはABCをあわせたもの。 ・フィラグリンとBHが皮膚において同じ場所に局在していることが分かった。

11 フィラグリンの脱イミノ化 ・(大腸菌に作らせた)人のフィラグリン8.39µMをmPAD3,0.17µMと37℃でインキュベートした。 ・インキュベーション時0,10,20,30,60,180,360minにおける抽出物を37℃で1時間インキュベートした。その時、Bではトリプシンと共にインキュベートした。 ・その後、SDS-PAGEを行った。 ・矢印はフィラグリンを、三角は脱イミノ化されたフィラグリンを、*はフィラグリンよりも低分子のタンパク質をそれぞれ表す。 ・A,Bを比較して、Bにおいてフィラグリンのバンドが検出ず、脱イミノ化フィラグリンのバンドは検出されることから、フィラグリンはトリプシンによって分解される。脱イミノ化すると、トリプシンに対して抵抗性を示すようになる。

12 Calpain1による脱イミノ化フィラグリンの分解
・Calpain1(0.32µM)とフィラグリン(6.32µM)を30℃でインキュベートした。 ・SDS-PAGEによって分解量を調べた。 ・初期の分解速度が非常に高く、10min以内に70%以上のフィラグリンが分解された。 ・脱イミノ化されたフィラグリンはより分解されやすい

13 Calpain1によるフィラグリンの分解産物 MS1
･Calpain1とフィラグリンをインキュベートしてから30秒後のMS. ･4000～40000(m/z) ･Aはフィラグリン、+は電荷を表している。 ･

14 Calpain1によるフィラグリンの分解産物 MS2
･CはCalpain1とフィラグリンをインキュベートしてから30min後のMSで4000～40000(m/z) ･EはCalpain1とフィラグリンをインキュベートしてから30min後のMSで4000～12000(m/z) ･Calpain1はフィラグリンを分解して、多数のペプチドを得る

15 Calpain1による脱イミノ化フィラグリンの分解産物 MS1
･Calpain1と脱イミノ化フィラグリンをインキュベートしてから30秒後のMS. ･4000～40000(m/z) ･Bは脱イミノ化フィラグリン、+は電荷を表している。 ･

16 Calpain1による脱イミノ化フィラグリンの分解産物 MS2
･DはCalpain1と脱イミノ化フィラグリンをインキュベートしてから30min後のMSで4000～40000(m/z) ･FはCalpain1と脱イミノ化フィラグリンをインキュベートしてから30min後のMSで4000～12000(m/z) ･Calpain1は脱イミノ化フィラグリンを分解して、多数のペプチドを得る

17 Caspase14による脱イミノ化フィラグリンの分解
・Caspase14(0.32µM)とフィラグリン(6.31µM)を37℃でインキュベートした。 ・SDS-PAGEによって分解量を調べた。 ・10min以内に70%以上のフィラグリンが分解された。 ・脱イミノ化されたフィラグリンの方が初期段階ではやや分解されやすい。 ・Calpain1の方がCaspase14よりも分解速度が速い。

18 Caspase14による脱イミノ化フィラグリンの分解産物 MS
･AはCaspase14と脱イミノ化フィラグリンをインキュベートしてから30秒後のMSで、3500～15000(m/z) ･BはCaspase14と脱イミノ化フィラグリンをインキュベートしてから60分後のMSで、3500～15000(m/z) ･Caspase14は脱イミノ化フィラグリンを分解するが、Calpain1に比べて分解産物のパターンは限定的である。

19 BHによって放出されるアミノ酸1 ･フィラグリンまたは脱イミノ化フィラグリンをCaspase14またはCalpain1と共に1時間インキュベート後、その分解産物をBHとインキュベートした。 ･フリーアミノ酸はｆluorescamineを用いて定量した。 ･白は脱イミノ化フィラグリンの、黒はフィラグリンの分解によって生じたアミノ酸を表す。 ･脱イミノ化フィラグリンの方がこれらの酵素によってアミノ酸を生成しやすい。

20 BHによって放出されるアミノ酸2 ･脱イミノ化フィラグリンの分解産物をHPLC分析した。 ･Calpain1による脱イミノ化フィラグリンの分解産物の方が、Caspase14のそれよりもBHによる分解反応を受けやすく、結果として様々な種類のアミノ酸が生じる。 ･Calpain1とBHは脱イミノ化フィラグリンを分解し、アミノ酸(NMF)を生成するのに不可欠である。

21 フィラグリンの分解