タンパク3000プロジェクト個別的解析プログラム

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1 タンパク3000プロジェクト個別的解析プログラム
　　 代謝系グループ 平成14年度 成果報告 　　 大阪大学大学院理学研究科 　　　　　代表：倉光成紀 　　　　副代表：増井良治

2 特殊環境微生物由来のタンパク質 代謝系グループ ターゲット ● 極限環境微生物
代謝系グループ　ターゲット 特殊環境微生物由来のタンパク質 ● 極限環境微生物 好熱性古細菌 Sulfolobus tokodaii（好気性，好酸性） Aeropyrum pernix（好気性），など 好冷菌（低温菌） Acinetobacter, Alteromonas, Flavobacterium ● 病原性微生物 ● その他 S. tokodaii A. pernix

3 タンパク3000「代謝系グループ」平成14年度連絡会
日　時 平成15年 1月 6日(月)1:00〜6:30 pm 場　所 大阪大学　豊中キャンパス 基礎工学部国際棟（Σホール） ディスプレイ室

4 代謝系グループ参加者（平成14年度）

5 構造解析／機能解析の終了したタンパク質（平成14年度）

6 平成14年度PDB公開済タンパク質 1LWB 1GIQ 1IWP 1KOL 1N7K 1L2L 1IZE 1UAZ

7 代謝系グループ 実施内容 ゲノム解析 （現 製品評価技術基盤機構による全塩基配列決定）
代謝系グループ　実施内容 ゲノム解析　（現 製品評価技術基盤機構による全塩基配列決定） ターゲットの選択： 新規ファミリー蛋白質，有用・重要蛋白質 タンパク質の調製： プラスミド作製，発現スクリーニング 　　　　　　　　　　　 大量発現，精製 立体構造解析： Ｘ線結晶構造解析，NMR による構造解析 機能解析：　　 反応速度論的解析，他 バイオインフォマティクスによる 蛋白質の構造・機能の体系化， 産業利用

8 発現用プラスミドの構築 pET-11a PCR, TA cloning ligation coding region BamHI BamHI
ATATCATATG TAATAAGGATCCATAT ATATCATATG TAATAAGGATCCATAT coding region PCR, TA cloning ligation pET-11a BamHI BamHI

9 発現用プラスミドの大量調製 形質転換体をチューブで直接培養し，プラスミド自動分離装置で調製する。

10 発現チェックの例 pET-11a Rosetta-gami(DE3) IPTG 誘導なし 熱処理沈殿 熱処理上清 破砕液沈殿 破砕液上清

11 高密度培養装置 ・温度，攪拌，pH，消泡，濁度，DO， 排気CO2，排気O2 を測定・制御 ・栄養源・発現誘導物質の自動添加
・培養液のオートサンプリング

12 高密度培養の例 pH ExCO2 DO OD あるORFの pET-11a で BL21(DE3) を形質転換 ↓ 形質転換体のコロニーを
　↓ 形質転換体のコロニーを 培地 3 L に直接植菌 pH 7.2, 37℃, 800 rpm で培養 グリセロールを追加 （IPTG誘導なし） 集菌 → 約100 g の菌体を回収 pH ExCO2 DO OD

13 タンパク質精製用システム