E. Coli Time Manager Since 2008

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1 E. Coli Time Manager Since 2008
iGEM Chiba 2009 E. Coli Time Manager Since 2008

2 iGEM CHBA 2009 の目標 ０９CHIBAは流れと精確性のある時間差スイッチをつくる！ 昨年度作成した時間差スイッチ
・別々の入力であるため、 　同一系内での時間の流れを表現することができない。 ・１通りの時間差しか生み出せていない。 ・蛍光強度の上昇し始めに差が見られない。 ０９CHIBAは流れと精確性のある時間差スイッチをつくる！

3 時間の流れをつくるには 並列型 直列型 ここでもう１点問題になってくるのは、どのように時間の流れを作るかです。
私たちは、時間の流れを作る方法として「直列型」と「並列型」の２種類を考えました。 「直列型」では、スライド左側の図のようにある入力を受けた回路が新たなシグナルを出し、それを受け取った回路がまた次のシグナルを出すという行為を繰り返すことで時間の流れを作ろうという案です。 A→B→C→D→E この案の利点は一つの系で多種の出力ができる点です。 例えば一番左側の回路にはGFP、真ん中の回路にはRFP、右側の回路にはYFPを組み込んでおけば、１回入力するだけで３色の蛍光が観測できます。 一方この案の欠点は１つが駄目になるとそこから下流の回路が発現しない点です。 この案のシステムを考えれば明白なことですが、全ての回路は自身の１つ上流の回路の出力を自身の入力として起動するため、１つでも出力できない回路があるとそこから下流の回路は起動できなくなってしまいます。 「並列型」では、スライドの右側にあるように、全ての回路が同じ入力で起動し、それぞれが違う出力をすることで時間の流れを作ろうという案です。 A→B A→C A→D A→E この案の利点は、どこかの回路が駄目になっても「直列型」のように止まらず、最後までそれぞれの回路が発現できるという点です。 例えばスライド右側の図の真ん中の回路が止まってしまったとしても、他の回路は起動しておりそれぞれの出力をすることができます。 一方この案の欠点は順番通りに発現できない可能性があるという点です。 それぞれの回路が個別に起動するため、A、B、Cの順に発現させたいとき、AからBが発現する回路とAからCが発現する回路の順番が入れ替わってしまう可能性があります。

4 並列型作成案 理由 LuxR Mutant選別実験 1 効果が得られそう。 LuxR Mutant parts作成実験 5
優先度 理由 LuxR Mutant選別実験 1 効果が得られそう。 LuxR　Mutant parts作成実験 5 選別実験が終わらないとてをつけられない。 細胞内カスケード作成実験 6 Ｍｕｔａｎｔで効果が得られなかった場合に行う。

5 直列型作成案 優先度 理由 細胞外カスケード作成実験 5 様々なことを調べてからつくるひつようある。 ポジティブフィードバック効果調査実験
4 パーツを作る前に効果を知る必要がある。 LasI　LasR稼動試験 2 昨年度起動していないため ペプチドクオラムセンシング稼動実験 3 Ｌａｓが動かなかった場合に必要となる。またＬｕｘとのクロストークがないので使えるのであればこちらを優先

6 絵を作ってみせるために知っておく必要がある →どれくらいの間を空けて菌を撒けばいいのか
デモンストレーション向け実験 優先度 理由 AHL拡散速度調査実験 6 絵を作ってみせるために知っておく必要がある →どれくらいの間を空けて菌を撒けばいいのか 本番用レポーター作成実験 カラフルだと見栄えがよい 6

7 並列型案①：LuxR Mutant Rapid Normal Delay
Sensitive luxR luxR Rapid Plux GFP Wild type LuxR luxR luxR Normal 次にLuxの変異体を用いたシステムについて説明します。 私たちはまず、感度の異なるLuxRを使えば容易に「遅れ」を作り出すことができるのではないかと考えました。 感度が高いほど応答までの時間は短くなります。 このシステムで得た時間差を利用して「並列型」の回路を作ります。 スライドの図では、敏感なもの、自然のもの、鈍感なものの３種を用いた場合を示しています。 このシステムの利点・欠点は「並列型」の回路と同じです。 - 元のメッセージを表示 - Probably, the most straightforward approach to make variations in delay time is to create a number of LuxR mutants with different sensitivity. We think the higher the sensitivity is, the shorter the delay time would be. The lower the sensitivity is, the slower the switch response should be. おそらく、時間を遅らせるバリエーションを作る最も簡単な方法は、異なった感度を持つLuxRの変異体をいくつか作ることです。 私たちは、感度が高ければ高いほど遅れは短くなると考えます。 感度が低ければ低いほど、スイッチの応答は遅くなるはずです。 AHL Plux GFP luxR Dyll luxR luxR Delay Plux GFP

8 並列型案①：LuxR mutant Mutant 選別実験
1, プラスミド混濁液を、元々pLux-GFPが入った株でtransformationする。 2, 各コロニーを96deepwellで液倍し、１sampleあたり、 4種類のAHL濃度（0, 1, 10, 100nM）×3＝12wellを使って培養。 30分毎に、蛍光強度を計測。 この時、Wild typeのLuxRもN.C.として培養＆計測する。 Q1、いくつSampleを扱えばいいのか？ Q2、何分ごとに蛍光強度を測定するのがベストなのか？ Q3、濃度の段階はどの間隔がベストなのか？

9 並列型案①：LuxR mutant Mutant parts 作成実験
Wild type よりも30分以上蛍光強度上昇の様子が早まったor遅れたモノだけ PCRでbiobrick仕様の制限酵素サイトをつけ、p15Aのプラスミドにのせる。 P15A LuxR mutant Q、ポジティブフィードバックは使えないのではないか。

10 並列型案②：細胞内カスケード pLac LuxI pTet LuxR pLux LacⅠ pLac CⅠ pλCⅠ GFP

11 直列型案：細胞外カスケード LuxI（OHHL）とクロストークしない組み合わせで 細胞外カスケードを作り、時間差を生み出す。
最終的に並列回路と同時に起動させたいので 最初のスイッチは LuxI（OHHL）で統一 今までは異種間のコミュニケーション、クロストークを利用していましたが 今回は逆にクロストークを行わないクオラムセンシングの組み合わせを利用して２段階の通信リレーを作ります。 まず入力をA号機が受信し、B号機だけが感知できるシグナル（AHL）を出します。 B号機はレポーター機にのみ感じられるシグナルを出します。 去年の通信を２段階にすれば、さらなる通信の遅れを生み出すことができるのではと考えました。 ただ溶液中に複数のシグナルが飛び交う状態になるのと、そこまで長い時間、複数の種類の菌が同じ環境下で生きていられるのかはわかりません。 pLac-LuxR pTet-LuxR pLux-GFP-??? pTet-??? p???-GFP LuxI（OHHL）とクロストークしない組み合わせで 細胞外カスケードを作り、時間差を生み出す。

12 直列型案：細胞外カスケード クロストークしない組み合わせ
LuxI protein family syntheses 異なる生物は、アシル鎖の長さ、あるいはC-3位の置換基が異なる種類のAHLを合成する。Vibrio fischeriは3OC6HSLを、Pseudomonas aeruginosaはC4HSL、C6HSL、および3OC12HSLを合成する。LuxRはAHLのoxo-C6～C14-HSLとC6～C12-HSLまでのAHL構造を、LasRはAHLのoxo-C10～C14-HSLとC10-C12HSLという構造を、RhlRはAHALのoxo-C10～C14-HSLとC4～C12-HSLという構造をそれぞれ認識する。LuxRはVibrio fischeri由来であり、低濃度の3OC6HSLに対して(~5nM)、応答する。しかし、他種生物由来のAHLに対しては、より高い濃度でないと遺伝子発現が起こらないことが分かっている。AHL合成速度が十分に遅いならば、LuxRは、3OC6HSLに対して最も早く応答し、他のAHLに対してはそれよりも遅く応答する。 グラム陽性菌(黄色ブドウ球菌)由来のクオラムセンシングのシステム。 agrBは膜貫通タンパク質で、agrDから発現するAIP前駆体を成熟AIPに変えて細胞外に出す働きがある。 agrCは膜に存在するレセプターで、AIPを受け取るとagrAをリン酸化し、活性化されたagrAがP2プロモーターのスイッチを入れる。 from Staphylococcus aureus AIP receptor and activator of P2 promorter agrB agrD agrA agrC From 07Cambridge

13 直列型案：細胞外カスケード システム構成案 Las型/ペプチド型
弐号機 零号機 初号機 pTet-LuxR pLux-LasI-Reporter pTet-LasR pLas-Reporter pLac-LuxI pTet-LuxR-AgrB pLux-AgrD pTet-AgrA-AgrD pLas-Reporter

14 直列型案：細胞外カスケード Lux-Las型 パーツ作成実験
零号機 : LuxI(Sender) BBa_K084012 を使用。 plac LuxI 初号機 : LuxR(Receiver ) + Reporter + LasI(Sender) 作成が必要。 ptet 　 LuxR plux 　　　GFP LuxI LasI 初号機 : pLuxの漏れ対策版 作成が必要。 ptet LuxR LacI plux/lacO GFP LuxI LasI 弐号機 : LasR(Receiver) + Reporter 作成が必要。 ptet 　 LasR 　　　plas 　 GFP LasI

15 直列型案：細胞外カスケード Lux-Las型 パーツ作成実験① LuxR-LasI
初号機 : LuxR(Receiver ) + Reporter + LasI(Sender) ptet 　 LuxR plux 　　　GFP LuxI LasI T9002 ptet 　 LuxR 　 plux 　　GFP C0061 　LuxI C0178 　LasI 1, T9002からPCRでターミネーターを取り除く。（Reverseプライマーデザイン必要） 2, C0061（LuxI）をつなげる。 3, ポジティブフィードバックの効果測定 4, C00178を作成して完成

16 直列型案：細胞外カスケード Lux-Las型 パーツ作成実験① ポジティブフィードバック効果調査
T9002 ptet 　 LuxR plux 　　 GFP 作成したパーツ ptet 　 LuxR plux 　　 GFP LuxI ①誤作動の有無の確認 　　AHLを加えない状態で培養し、GFPの漏れの有無を調べる。 　　誤作動が見られた場合→ plux/lacO 版を作成 or Las型パーツ作成中止 ②効果の有無の確認 　　T9002（元のパーツ）との蛍光強度の上がり方を比較する。

17 直列型案：細胞外カスケード Lux-Las型 パーツ作成実験① 漏れ対策pLax/lacO
初号機 : pLuxの漏れ対策版 ptet LuxR LacI plux/lacO GFP LuxI LasI S03600 pTet LuxR C0012 　LacI K091100 plux/lacO E5501 RBS+GFP C0061 　LuxI C0178 　LasI ３とおりのパーツ作成方法 1, 3ステップでつなげる 2, 部分的に合成する。 3, 前合成する。

18 直列型案：細胞外カスケード Lux-Las型 パーツ作成実験②
弐号機 : LasR(Receiver) + Reporter ptet 　 LasR 　　　plas 　 GFP LasI R0040 pTet K091118 　 LasR 　　　plas 　 GFP C00178 　LasI 1, K091118からPCRで下流のターミネーターを取り除く。 　 （Reverseプライマーデザイン必要） 2, R0040をつなげる。 3, さらにC00178をつなげて完成。

19 直列型案：細胞外カスケード Lux-Las型 Las Check
Plac LasI Ptet LasR Plas GFP

20 見せるための実験①： AHL拡散の様子＠固体培地
・LuxI：OHHLのチェック BBa_T9002を導入した大腸菌を撒いた固体培地にOHHLを滴下し、 各コロニーの蛍光強度が一定に達するまでの時間を測定する ・LasI：OdDHLのチェック BBa_K091134を大腸菌に導入し、 IPTGを入れた固形培地に撒いてOdDHLを滴下して各コロニーの 蛍光強度が一定に達するまでの時間を測定する ・Luxのほうはptet　Lasのほうはplac　この違いは問題だろうか

21 見せるための実験②： 複数のレポーターの準備
初号機のGFP部分の色違いのパーツです。 赤色:BBa_I731012 Ptet LuxR plux RFP 黄色:BBa_K084003 Ptet LuxR plux YFP これらに初号機（BBa_T9002）と同様にLuxI:BBa_C0061、LasI:BBa_C0178をつけることによって蛍光色のバリエーションを作ろうと思っています。

22 直列型案：細胞外カスケード ペプチド型 パーツ作成実験
零号機 : LuxI(Sender) BBa_K084012 を使用。 plac LuxI 初号機 : LuxR(Receiver ) + Reporter + AIPSender ptet 　 LuxR plux GFP 　　　AIP Sender 作成が必要。 I746101 弐号機 : AIP Detector(Receiver) + Reporter AIP Detector + Reporter I746220 作成不要 作成が必要。

23 直列型案：細胞外カスケード ペプチド型 パーツ作成実験
初号機 : LuxR(Receiver ) + Reporter + AIPSender ptet 　 LuxR plux GFP 　　　AIP Sender T9002 ptet 　 LuxR 　 plux 　　GFP I746009 　 　　　AIP Sender 1, T9002からPCRでターミネーターを取り除く。（Reverseプライマーデザイン必要） 2, I746009つけてかんりょう