北里大学薬学部3年前期選択　2008年4月-7月　12回 担当者　梅山秀明、竹田-志鷹真由子、寺師玄記、加納和彦

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1 分子の立体構造と生命講義　７回目 3-Dimensional Molecular Structure for the Life Science
北里大学薬学部3年前期選択　2008年4月-7月　12回 担当者　梅山秀明、竹田-志鷹真由子、寺師玄記、加納和彦 毎週月曜日4時限　2：30-3：45　港区白金キャンパス1501教室 Hideaki Umeyama, Ph.D., Professor School of Pharmacy, Kitasato University 5-9-1 Shirokane, Minato-ku, Tokyo , Japan phone : fax : 港区白金５－９－１ 北里大学薬学部教授 （理化学研究所客員主管研究員、東北大学未来研客員教授） 梅山秀明

2 他のドッキングソフトとの 結合モード予測成功率の比較(1)
PDBに登録されている複合体既知構造でのテスト （116ターゲット；実験構造とRMSDが2Å以下で予測成功） ChooseLD Onodera et. al. J. Chem. Inf. Model. 47, (2007) Tc:Tanimoto係数 実験情報が増えるに従い、予測精度が上昇していくと考えられる。 2

3 他のドッキングソフトとの 結合モード予測成功率の比較(2)
PDBに登録されている複合体既知構造でのテスト （９０ターゲット；GOLD,Glideの計算条件下;予測成功ターゲットの分布 ） 成功するターゲットにばらつきがあり、様々な手法を併用することが新規阻害剤発見に必須であると考える。 3

4 Epidermal growth factor receptor (EGFR) を
(1) ChooseLDのドッキング性能　 T85 のベンチマークセットをもちいたk1の最適化 T133 を用いた予測精度の検証 (2) ChooseLDのインシリコスクリーニング性能 　Epidermal growth factor receptor (EGFR) を 　　ターゲットとした場合のk2 とk3の最適化 と 　　　　　インシリコスクリーニング

5 EGFR kinase domain の阻害剤の探索を サンプルとしてk2,k3を最適化する
ゲフィチニブ （イレッサ）などが阻害

6 ファミリータンパク質立体構造アライメントによってEGFRの活性部位(kinase domain) に複合体リガンドを集める。
このタンパク質結合リガンド群かから必要な部品である三次元ＦＰ　を使って 未知の化合物リガンドをドッキングする

7 EGFR inhibitor情報の入手先

8 IC50既知化合物一覧（EGFR inhibitor １１個）
3um/L 3um/L 3nm/L 0.8um/L 1.2um/L 11nm/L 5um/L 2.4um/L 0.35um/L 35um/L 1.3um/L

9 Simulated annealing Simulated annealing 新規関数FPAScore が 最も高い複合体構造で解答する

10 K2 =2.0のEnrichment curveが最適である
MDL CMC Libraryと新たに加えた IC50既知 化合物(EGFR inhibitor １１個)とを用いたk2値の最適化 Enrichment curve k2 K2 =2.0のEnrichment curveが最適である

11 K3の変化に対してEnrichment curveが
IC50既知化合物(EGFR inhibitor １１個)とMDL CMC Library を用いたk3値の最適化（k2 = 1.0を使用した） K3の変化に対してEnrichment curveが あまり変化しなかったので、k3 = 1.0とした。

12 Tc 下限値の最適化 (上限値 1.00, 下限値 x ) (k1 = 4.0, k2 =2.0, k3 = 1.0)
FP Library に対するリガンドの類似性Tanimoto 係数(Tc) 下限値 x Minimum Tc をいろいろと変更する。 0.32 が悪いのは、ライブラリーリガンドが極端に減っているためである。 FP Library に対するTc の下限値は 0.24 のときに良好なEnrichment curveが得られた。 あまり似ていないタンパク質結合リガンドは含まない方が良い。 反対に、似ているものだけに絞っても好ましくない。

13 EGFR（Epidermal growth factor receptor）をターゲットタンパク質としたインシリコスクリーニングの条件設定（IC50既知化合物の順位）
Fingerprint libraryに含めるリガンドと試薬との類似度の下限値 Epidermal growth factor receptor 500位までに既知活性化合物が５個出現する。 13

14 試薬ライブラリ (MDL ACD Library)に対する インシリコスクリーニングのための 絞込み条件１
下記のEGFR 特異的　FP band と試薬ライブラリ(MDL ACD Library)の各化合物のFP band のTc を算出する 上記の記述に従って、計算されたTcの大きい順から試薬ライブラリを20000 化合物までに絞り込む。 EGFR 特異的　FP band

15 EGFR のATPを基質とするkinase ドメインに対する インシリコスクリーニングの結果（１００位まで表示）
試薬ライブラリに ATP 誘導体が多く存在する オレンジはＰ原子 上記のオレンジはリン原子であり、ほとんどがATP 誘導体であるため 新規阻害剤を探索する際には、ATP 類似体は省く必要がある。 ATP誘導体を除外し、試薬ライブラリからドラッグライクの化合物を抽出する必要がある。

16 試薬ライブラリ (MDL ACD Library)に対する インシリコスクリーニングのための 絞込み２: ドッキング構造絞り込み
分子量３５０以上８００以下の低分子、リンを含まない。 重要な水素結合をしているか。(METの主鎖の窒素) タンパク質ーリガンドの衝突 2.0 A 以下が存在するドッキングリガンド分子をのぞき上位を選択した。

17 Kinase ドメインの空間内における立体構造相補性を満たす 重要な水素結合を満たすドッキング構造がランキング内に存在した。
FPAScore 上位１０個を表示（スティックモデル） Kinase ドメインの空間内における立体構造相補性を満たす 詳細はお見せできませんが、既知のホモロジーのあるkinase の複合体情報から 得られた水素結合情報(METM__98) などを満たしている化合物を スクリーニングすることができた。 重要な水素結合を満たすドッキング構造がランキング内に存在した。 購入可能な試薬(MDL ACD Library)であるので、すぐにでもEGFR kinase阻害剤の活性値の測定が可能である。

18 既知阻害剤から得たFP Library を使用して、 EGFR kinase ドメインに対するインシリコスクリーニング:
FP Library を工夫することによりATP誘導体をさける事が可能である。

19 結果のまとめ 新しく定義したFPAScore をSA（ Simulated Annealing）で最適化することによって、Rmsd 2.0 A 以下で予測できる割合はGOLDと同程度である。 Tc　上限値が低く設定した場合は DOCK, AutoDock と同程度であった。 ChooseLDはGlide, GOLD, FlexXと比べて独自性があった。 FPAScoreによるEGFRに対するドッキング構造の順位付けに関して、k1 = 4.0, k2 =2.0, k3= 1.0 既知阻害剤を上位に順位付けできるenrichment curveが得られた。 EGFR kinase ドメインに対するインシリコスクリーニングにおいて有望と考えられる化合物セットを得ることができた。（実験で証明の必要有）

20 ChooseLDの適用例（結合実験の証明が必要）
1. Epidermal growth factor receptor (EGFR)の TGFα binding ドメイン 阻害剤のインシリコスクリーニング 2. Vascular endothelial growth factor (VEGF) Receptor- 2 にKRN633, KRN951をドッキング 3. Plasmodium falciparum enoyl acyl carrier protein reductase に対する低分子(NAD)が介在した状態でのドッキング

21 EGFR のTGFα binding ドメインの阻害剤の探索
二量体形成 阻害

22 EGFR二量体形成阻害剤のインシリコスクリーニング
TGFα binding domain EGFR (PDBID : 1MOX) EGFRが二量体を形成するために必要なペプチドであり、 阻害剤のターゲットとなる

23 タンパク質-タンパク質相互作用をFP Library をとして使用できることを示した。
TGFα binding ドメイン 近傍に TGF類似体のペプチドをFAMS Complex で モデリングし、その側鎖を切り出した。 （同じFPが多数得られる主鎖は除いた。） これから活性をはかる都合上詳しい平面構造は表示できない。 医薬品をドッキング 試薬をドッキング タンパク質-タンパク質相互作用をFP Library をとして使用できることを示した。

24 VEGFR-2 に対するKRN633, KRN951ドッキング構造の予測
IC50 = 1.16nm/L Mol Cancer Ther 2004;3(12). VEGF 血管内皮増殖因子である。 FAMS( J Mol Graph , (2000)) でモデルを構築 （鋳型PDBID:2P2H_A Homology:99.3%）残基欠損を補うため KRN951 IC50 = 0.16nm/L Cancer Res 2006; 66: (18).

25 Simulated annealing 新規関数FPAScore が 最も高い複合体構造で解答する KRN633

26 予測構造のばらつきが少なく、信頼できる予測構造と考える。
VEGFR2 にKRN633をドッキング ドッキングに使用されたFP Library の上位１０個のPDBID 2HZN_A , 1YWN_A , 2J5F_A , 2IVU_A , 2H8H_A , 2OH4_A , 1GAG_A , 1FPU_A ,2C0I_A , 2P4I_A ChooseLDによる予測構造 10 個 Tc range １０個とも同様の構造が得られた。 予測構造のばらつきが少なく、信頼できる予測構造と考える。

27 VEGFR-2 にKRN951をドッキング ドッキングに使用されたFP Library の上位１０個のPDBID
Maximum value of Tc in FP DOCK 並 約20.8%　29.2%の間で成功している。 ドッキングに使用されたFP Library の上位１０個のPDBID 2I0V_A , 2HZN_A,　2OH4_A , 1FGI_A , 1YWN_A , 1FPU_A , 2OFU_A, 2C0I_A , 2H8H_A , 2FGI_A ChooseLDによる予測構造 10 個 使用Tc range FP Library Tc Maximum (0.29) 推定成功率24.3% 予測構造１０個中８個がほぼ同じ構造であった。

28 NADを含んだ複合体をターゲットとした。
Plasmodium falciparum enoyl acyl carrier protein reductaseに対する低分子(NAD)が介在した状態でのドッキング 既知阻害剤 NAD NAD を介した阻害剤候補のデザインも可能である。 マラリア HEMでもＨＯＨでもできる。 NADを含んだ複合体をターゲットとした。

29 医薬品ライブラリからドッキングし FPAScore上位１０構造を解答
NAD ChooseLDはNAD, 水などの低分子が介在してもドッキングが可能である

30 Fingerprint alignment

31 ChooseLD（CHOOse biological information Semi-Empirically on the Ligand Docking）法による リガンドドッキング
ターゲットタンパク質の 三次元座標 ターゲットリガンドの 三次元座標 複合体構造を予測 31

32 PDBに対するホモロジー検索。 既知タンパク質ーリガンド複合体構造を入手
ChooseLD法　概要 PDBに対するホモロジー検索。　　　　　　　　　　　　　既知タンパク質ーリガンド複合体構造を入手 タンパク質の立体構造アライメントにより、リガンドをターゲットタンパク質の座標系に変換し、figerprint library構築 　（基本的な考え方：相互作用自由エネルギーを満たすと仮定したfigerprintを用いる） フレッキシブルリガンドドッキング C/C++で記述した。約20,000行。 テキスト処理はスクリプト言語(Perl Ruby等)を用いた。 32

33 ChooseLD法　FPAScore(fingerprint alignment score)　 自由エネルギー最小を満たすようなfingerprintを選び出す関数
　　　ドッキング項（Figerprintの一致度） 結合部位との衝突項 結合部位との 接触項 33

34 並列計算を常時利用 大量の計算を複数の計算機に分散する
並列計算を常時利用　 大量の計算を複数の計算機に分散する 計算の分散 結果の収集 計算機の数が増えるほど 　試薬リストを速く得ることができる 　大量のターゲットタンパク質に対してインシリコスクリーニングが可能となる 　ChooseLD法の使用プロトコル(rsh；メモリ非共有型並列計算) その他のプロトコル 世界中のネットワークにつながっている個人使用のデスクトップコンピュータを計算資源にする試み(BOINC等) 34

35 バーチャルライブラリの構築 （リガンドドッキングの準備過程）
MDL® Available Chemicals Directory（年4回更新） MDL® Comprehensive Medicinal Chemistry(年1回更新) ナミキ商事　HTS 300万化合物 PostgreSQLを用いたテーブルによる化合物絞り込み、および 検索高速化 Tanimoto係数検索用関数をPostgresSQLの拡張関数として C言語で実装 35

36 インシリコスクリーニングの結果整理 （阻害剤候補リスト）
SQLiteによる検索プログラムの実装 細かな検索条件の指定が可能（Perl、 Rubyで実装した） Webインターフェイスを介した結果の視覚化 ディスカッションに 使用できる。 36

37 iPS細胞時代における インシリコスクリーニングの役割
テーラーメイド医療 個人特有の細胞、組織、臓器 In-vitro とin-vivo の中間の活性試験 in-vivo 活性試験 in-vitro 活性試験 新薬の有効性、安全性試験 インシリコスクリーニングの加速が必要となる。 37

38 結論 新しく定義したFPAScore を用いるバイオインフォマティクスに基づいたリガンドドッキングとインシリコスクリーニング法、ChooseLD を開発した。 FPAScore をSimulated Annealing で最適化する方法によって、Rmsd 2.0 A 以下で予測できる割合はGOLDと同程度であり、Tc上限値が低い場合は DOCK, AutoDock と同程度であった。 性能は既存の古典的物理関数を用いるアルゴリズムと同程度であり、Glide, GOLD, FlexXと比べて独自性があった(従来法との併用でインシリコスクリーニングの精度が上昇すると期待される)。 EGFR のkinaseドメインを用いてターゲットタンパク質に応じて、FPAScore のk1, k2, k3 を最適化することにより良好なenrichment curve が得られることを示した。 応用としてEGFR dimer 阻害剤インシリコスクリーニング、VEGFR-2に対するKRN633, KRN951をドッキング、マラリアの標的タンパク質に対するインシリコスクリーニングでChooseLDの可能性を示した。

39 今後の検討課題 最適化アルゴリズムの改良 遺伝的アルゴリズム、レプリカ交換法等
　　遺伝的アルゴリズム、レプリカ交換法等 配列的に似ていない既知複合体構造からFP Library Ligand をえる PSI-Blast : Sequence-Profile Alignment -> Profile-Profile Alignment FP が全く存在しない場合への対応 3D1Dスコアが優位になるようにリガンドを配置 既存物理関数のドッキングソフトを用いてFP Library Ligand を作成

40 現状の課題 最適化アルゴリズムの改良 遺伝的アルゴリズム、レプリカ交換法等 配列的に似ていない既知複合体構造からFP Library を得る
　　遺伝的アルゴリズム、レプリカ交換法等 配列的に似ていない既知複合体構造からFP Library を得る PSI-Blast (Sequence-Profile Alignment) に加えて SPARK2, SP3 (Profile-Profile Alignment) FP が全く存在しない場合への対応 　3D1Dスコアが優位になるようにリガンドを配置したり、古典的物理関数のドッキングソフト等を用いてFP Library を構築する * 将来、PDBの登録数の増加に伴い、ChooseLDの精度が向上すると考える。

41 バイオインフォマティクスに基づいた リガンドドッキングと インシリコスクリーニング法の開発
下記の発表資料を参考にしました。 バイオインフォマティクスに基づいた リガンドドッキングと インシリコスクリーニング法の開発 平成19年12月3日　課程博士　公開論文発表会 生物分子設計博士課程 DP 高谷大輔 指導教授　梅山秀明

42 分子の立体構造と生命講義　７回目 3-Dimensional Molecular Structure for the Life Science
北里大学薬学部3年前期選択　2008年4月-7月　12回 担当者　梅山秀明、竹田-志鷹真由子、寺師玄記、加納和彦 毎週月曜日4時限　2：30-3：45　港区白金キャンパス1501教室 Hideaki Umeyama, Ph.D., Professor School of Pharmacy, Kitasato University 5-9-1 Shirokane, Minato-ku, Tokyo , Japan phone : fax : 港区白金５－９－１ 北里大学薬学部教授 （理化学研究所客員主管研究員、東北大学未来研客員教授） 梅山秀明