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Real Time PCR Ver.2.00 R Q TaqManプローブ法
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Taq Man プローブの構造 Taq Man プローブが単独であるとき、レポーター色素の励起光を照射するとレポーターが蛍光を発しますが、レポーター色素の蛍光波長がクエンチャー色素の励起波長に近似しているため(約500~600nm)レポーターの蛍光エネルギーはクエンチャーの励起エネルギーとして使用され、クエンチャーが蛍光を発します。このためTaq Man プローブが単独であるときには、レポーターの蛍光が抑制されます。 励起光 Q R
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蛍光共鳴エネルギー移動現象 光励起 光励起 蛍光、熱など 光励起 FRET
蛍光共鳴エネルギー移動現象 FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)とは・・・. D + + A + D 光励起 励起状態 光励起 蛍光、熱など 光励起 FRET D 基底状態 励起された蛍光団 (Donor : D+) は,そのエネルギーを蛍光や熱エネルギーとして放出しようとする. 特定の条件を満たす分子 (Acceptor : A) が存在すると,共鳴による励起エネルギーの移動 (FRET) が起こる.この時,エネルギーを失った Donor は基底状態にもどり,同時にエネルギーを受け取った Acceptor は励起状態となる. D を励起し,FRET が起こると,励起状態の A を得ることができる.例えば蛍光物質である場合,D を励起すると,(FRETが起こり)A が励起されるため,A からの蛍光を得ることが可能である.
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95℃ Q R Forward Primer 5´ 3´ 5´ 3´ 5´ 5´ 3´ 5´ Reverse Primer
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95℃ Q 70℃ R Forward Primer 5´ 励起光 5´ 3´ 3´ 5´ 5´ 3´ 5´
Taq ManプローブはPrimerよりも先にハイブリダイゼーションする(68~70℃付近) Reverse Primer
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70℃ Q R 60℃ 励起光 Forward Primer 3´ 5´ 5´ 3´ 5´ 3´ 5´ 5´ Reverse Primer
Taq Manプローブの次にPrimerがハイブリダイゼーションする(58~60℃付近)
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60℃ Q R 励起光 Forward Primer 5´ 3´ 5´ 3´ 5´ 5´ Reverse Primer
PrimerにDNAポリメラーゼが結合して伸長反応が進む。
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60℃ R Q 励起光 Forward Primer 5´ 3´ 5´ 3´ 5´ 5´ Reverse Primer
DNAポリメラーゼの伸長方向にDNAがあると、5´-3´エキソヌクレアーゼ活性により分解される。
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励起光 60℃ Q R 3´ 5´ 3´ 5´ 3´ 5´ 5´ 3´ Taq Manプローブが分解されるとレポーターとクエンチャーが離れ、レポーター色素の蛍光が検出できる。
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Taq Manプローブの利点 Taq Manプローブの欠点
プローブが分解されることにより生じる蛍光を検出するので、目的DNAの増幅を正確に反映する。( SYBR Greenを使用するときには気をつけなくてはいけない、Primerダイマーなどの非特異的反応は検出されない。) Taq Manプローブの欠点 Primerとアニール温度が異なるようにプローブの設計に注意しなくてはいけない(難しい)点がある。( SYBR Greenを使用するときはPrimerを用意するだけですむ。)プローブが高価である。 参考文献 羊土社 ここまでできるPCR最新活用マニュアル、Applied Biosystems Japan資料、 タカラバイオ株式会社
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