エラスチカ・ワンギーソン染色 Elastica van Gieson stain (EV染色)

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1 エラスチカ・ワンギーソン染色 Elastica van Gieson stain (EV染色)

2 目的 原理 結合組織のなかの弾性線維と膠原線維を染め分け、かつ筋線維等との鑑別も可能であるという同時多目的染色法。
ワイゲルトの弾性線維染色法で弾性線維を染色し、ピクリン酸で筋線維、酸性フクシンで膠原線維を染色する。 原理 筋組織：筋細胞と呼ばれる特殊な細胞からできた組織である。筋細胞は、細胞内に、アクチン、ミオシンなどの蛋白質が配列した筋原線維を大量にもち、それが伸び縮みすることで、細胞全体の長さを変えることができる細胞である。 収縮することにより力を発生させるものである。 膠原線維（コラーゲン）：真皮、靱帯、腱、骨、軟骨などを構成するタンパク質のひとつで、多細胞動物の細胞外基質（細胞外マトリクス）の主成分である。基底膜。血管内皮細胞。 染色原理としては、弾性線維に含まれるポリペプチド鎖、粘液多糖結合したタンパクがレゾルシン・フクシンと化学結合して紫黒色を呈する。 色素粒子の大小差によってピクリン酸は筋原線維や細胞質、赤血球等と親和性を示し、酸フクシンは膠原線維や細網線維と親和性を示す。

3 試薬 教科書 細胞組織 大谷法 ワイゲルトのレゾルシン・フクシン液 ワイゲルトの鉄ヘマトキシリン ワンギーソン液 オルセイン ギムザ
　ワイゲルトのレゾルシン・フクシン液 　ワイゲルトの鉄ヘマトキシリン 　ワンギーソン液 細胞組織 　オルセイン 　ギムザ 　ワンギーソン 大谷法 　レゾルシンフクシン 　ギムザ 　ワンギーソン レゾルシンフクシン：弾性・平滑筋・細網線維 ヘマトキシリン：核 ワンギーソン：膠原・筋 オルセイン：核・染色体・弾性 ギムザ：血液・核・細胞質 ワンギーソン液 　 ピクリン酸飽和水溶液（2ｇ/dl）　　　　 100ml 　 1%酸フクシン　　　　　　　　　　　　10～15ml

4 レゾルシン・フクシン(保存液)の作り方 ※市販品を使っています
　塩基性フクシン　　　　2g 　レゾルシン　　　　　　　5g 　蒸留水　　　　　　　　200ml 　29%塩化第2鉄　　　25ml 染色液はレゾルシン・フクシン保存液10mlに 70%アルコール100ml、濃塩酸2mlを加えて使用する。 乳鉢でフクシンとレゾルシンをよく砕き、蒸留水を加えて溶解する。この液を蒸発皿へ入れ替え、はじめはとろ火で色素を溶解し、次に強火で30分くらい沸騰させる。液量が最初の半分ほどになったところへ29%塩化第2鉄溶液を加え、5~10分ほど沸騰の後、室温で放置して冷却する。 液は黒紫色で上にギラギラと金属性の光沢をもった沈殿物が残るので、水流ポンプで染色液を濾過する。濾過後、ロートに水を注入して色素沈殿物をよく洗う。濾過廃液がごく薄い桃色になるまで水を流し、50%エタノールでよく洗って無色透明になるまで水洗する。 その濾紙を37℃ふ卵器中で乾燥させて小さくきってから、純アルコール200mlを大き目の蒸発皿に入れて5~10分加温溶解して沸騰させる。冷却後、最終的に200mlになるようにアルコールを加えて保存原液とする。 レゾルシン・フクシンは試薬として売っている。

5 教科書による染色法 70％アルコールで分別 ３回 流水水洗 脱水・透徹・封入 脱パラ・流水水洗 レゾルシン・フクシン液
70％アルコールで分別　３回 流水水洗 脱水・透徹・封入 脱パラ・流水水洗 レゾルシン・フクシン液 アルコールで分別　３回 流水水洗 ヘマトキシリン ワンギーソン液 5～ 10分 2～ 3分 教科書では鉄ヘマトキシリンを使い、脱色もしているが、細胞組織では普段使っているヘマトキシリンな為にヘマトキシリン後は水洗になっている。 また、ワンギーソンの時間は染色を比べるために１０分で染色した。 30分～ 12時間 各 3分

6 細胞組織（旧大谷法）の染色法 脱パラ・流水水洗 オルセイン 1％塩酸アルコールで分別 流水水洗 5％ギムザ溶液 軽く水洗 ワンギーソン
分別脱水・封入 10分 60分 10分 10分 元々細胞組織で採用していた方法。 大谷先生が使い始めたもの？ 30秒

7 新大谷法 脱パラ・流水水洗 レゾルシン・フクシン 流水水洗 5％ギムザ溶液 軽く水洗 ワンギーソン 分別脱水・封入 10分 10分 10分
大谷先生が旭川医大のものを染める時に使った方法。 大谷先生はこの色が好きなよう。 60分

8 注意 ワンギーソン液の分別は70%アルコールでは手早く行い、純アルコールは少し長めに行うと良い。
　ワンギーソン液の分別は70%アルコールでは手早く行い、純アルコールは少し長めに行うと良い。 　分別が失敗すると、標本全体がフクシンの薄いピンク色になり、ピクリン酸の黄色調だけが強調される。 　キシロールでピクリン酸は急速に退色するので、長時間おくことのないように注意する必要がある。 ギムザは色落ちしやすいので長時間水洗しない。

9 染色結果 弾性線維 紫黒色 細胞核 黒褐色 膠原線維 赤色 筋線維 黄色 細胞質
                                                                                                                                                  染色結果 弾性線維 紫黒色 細胞核 黒褐色 膠原線維 赤色 筋線維 黄色 細胞質 （右）心筋梗塞により，心筋壊死に陥った部分は肉芽組織化し，やがて硝子化して膠原線維に置き換わる．膠原線維は酸性フクシンで赤色に，元々存在する筋線維は黄色に染まる． pathology/e-learning/pages02/a/a3p.html

10 心臓の動脈 教科書 細胞組織 大谷法 外弾性膜 弾性線維 内弾性版 核 膠原線維
※教科書の鉄ヘマトキシリンは無かったので、普段使っているマイヤーのヘマトキシリンで代用。 レゾルシンフクシン：教、大 オルセイン：細 ヘマトキシリン：教 ギムザ：細、大 全部最後にワンギーソン 弾性繊維：細長い単線維からなり、伸縮性を要求される器官に多く分布する。HEでは染まらない。 　　　　　オルセイン、ワイゲルト、ウェルフォフ、アルデヒドフクシン、レゾルシンフクシンで染まる。 核 膠原線維 心臓の動脈

11 腎臓の血管 教科書 細胞組織 大谷法 核 弾性線維 赤血球 膠原線維 内膜 中膜 内弾性膜 外膜
問題点：オルセインは９９年に作ったものなので、染色性が落ちているかもしれない。 　　　　レゾルシンフクシンは申し込みした先生の持ち物。 色の違いについては、好みにもよるが、染め分けができていれば問題はない。 細胞組織について、心臓では弾性膜が紫に染まっているのに、ここでは赤く染まっている。 膠原線維 腎臓の血管