下水試料中の女性ホルモン 測定法の課題 －LC/MS/MSとELISAの比較から－

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1 下水試料中の女性ホルモン 測定法の課題 －LC/MS/MSとELISAの比較から－
建設省土木研究所 ○高橋明宏、小森行也、矢古宇靖子、 　岡安祐司、斉藤正義、東谷忠、田中宏明

2 背景・目的 17βｴｽﾄﾗｼﾞｵｰﾙの内分泌攪乱作用大 下水の内分泌攪乱作用にしめる割合大 実態調査（下水道）はＥＬＩＳＡ法を使用
ＥＬＩＳＡ法は測定簡易 buｔ 正・負の誤差 ↓ LC/MS/MSを用いた測定法の検討 ＥＬＩＳＡ法の測定値を確認

3 LC/MS/MS法の検討 GC/MS ： 誘導体化が必要 抱合体の分解必要 形態別の把握が困難 LC/MS/MS： 誘導体化が不要
　　　　　　 　抱合体の分解必要 　　　　　　　 形態別の把握が困難 LC/MS/MS： 誘導体化が不要 　　　　　　　 抱合体の分解不要 　　　　　　　 形態別の把握が可能 使用装置 ： FINNIGAN　TSQ7000

4 条件検討①　ｲｵﾝ化法と特定ｲｵﾝ

5 条件検討②　MS/MS測定条件 ｲｵﾝ強度が減少、BGが低下、S/N比が10倍以上向上

6 測定条件 LC/MS/MS法 装 置：TSQ7000、HP1100
ｶﾗﾑ：HP Zorbax Eclops XDB-C18、2.1×150mm 移動相：ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ/水（60:40）、0.2mL/min 注入量：10μL ｲｵﾝ化 ：AP-ESI Negative、Collision Energy 　　　　　　40eV、 Argon mTorr　　　　　 測定質量数：271( Parent )、145( Daughter )

7 供試試料　（下水試料） １１年７，８，９月、スポット、流入と放流

8 試料調整 LC/MS/MS（抽出） 試料1000ml SS ろ過 ろ液 超音波抽出（アセトン） Ｃ１８固相抽出
溶出（EtOAc/MeOH＝1/5） 乾固 抽出物

9 未精製試料の測定 Standard Influent 17βEstradiol 17βEstradiol-d3
未精製試料の測定　　 Standard Influent 17βEstradiol m/z=271 17βEstradiol-d3 m/z=273 Ethnyl Estradiol m/z=295 4.6×150mm、MeCN/H2O=6/4、0.4ml/min

10 精製方法　　TLC法 Silica Gel 60 (MERCK)、CHCl3/ｱｾﾄﾝ=9/1 回収率は60～70％ 抱合体の精製は不十分

11 精製した試料の測定 （TLC） 精製後 精製前 17βEstradiol 17βEstradiol-d3 Ethnyl Estradiol
m/z=271、145 17βEstradiol-d3 m/z=275、145 Ethnyl Estradiol m/z=295、145

12 精製方法 抽出法・ｶﾗﾑ法 抽出法 ： 親水性成分の除去 EtOAc、EtOEt、n-Hxに溶解、食塩水で抽出
精製方法　　抽出法・ｶﾗﾑ法 抽出法 ： 親水性成分の除去 　　EtOAc、EtOEt、n-Hxに溶解、食塩水で抽出 　　n-Hx／食塩水の組み合わせが良好 ｶﾗﾑ法 ： 疎水性成分の除去 　　ｼﾘｶｹﾞﾙ、ｼﾘｶｹﾞﾙDEA、ﾌﾛﾘｼﾞﾙを比較 　　ﾌﾛﾘｼﾞﾙｶﾗﾑにより良好に精製

13 試料調整 LC/MS/MS（精製） 抽出物 Hex：塩水抽出（ボウ硝脱水） Hex/CH2Cl2＝1/1 ﾌﾛﾘｼﾞﾙｶｰﾄﾘｯｼﾞ
EtOAc/ CH2Cl2＝1/19 ｼﾘｶｹﾞﾙTLC（CHCl3/ｱｾﾄﾝ＝9/1） Rf 0.35～0.55・MeOH 測定試料（MeOH・1000倍）

14 測定の精度　　標準物質 2～18ng/Lの標準混合溶液 IS：17βE2-d3　　　　　　　　　　　　　　＊ng/L 標準偏差の３倍を検出下限とした、

15 添加回収試験　下水試料

16 実試料の測定結果　 LC/MS/MS法

17 試料調整 ELISA法 試料1000ml ろ過 SS ろ液 Ｃ１８固相抽出（MeOH溶出） 超音波抽出（MeOH） 乾固
測定試料（10000倍・DMSO）

18 測定方法 ＥＬＩＳＡ法 ①希釈試料（20％ DMSO溶液） ②抗体結合マイクロプレート ↓←酵素標識E2、試料、E2抗体
測定方法　　ＥＬＩＳＡ法 ①希釈試料（20％ DMSO溶液） ②抗体結合マイクロプレート 　　　↓←酵素標識E2、試料、E2抗体 ③抗原抗体反応（室温、2時間） 　　　↓←洗浄、発色試薬 ④発色反応（室温、暗所、30分） 　　　↓←反応停止薬 ⑤測定（プレートリーダー、450nm）

19 実試料の測定結果　ＥＬＩＳＡ

20 ELISAとLC/MS/MSの比較（流入）

21 ELISAとLC/MS/MSの比較（流入）

22 まとめ LC/MS/MS法の測定方法を検討 17βE2の誘導体、抱合体も検出可 試料の精製が必要(検出下限0.3ng/L)
５処理場の流入と放流を３回測定 ＥＬＩＳＡ、LC/MS/MSを比較すると 　　流入は2.0～8.3倍（平均4.7倍） 　　放流は1ppt以下（LC/MS/MS）

23 今後の予定 LC/MS/MS法の前処理法の検討 抱合体の測定検討 ELISA法の測定値が高い要因の検討 ELISA法の前処理法の検討
生物影響との関係把握