旭川医科大学教育研究推進センター 阿久津 弘明 化学 中村 正雄、津村 直美

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1 旭川医科大学教育研究推進センター 阿久津 弘明 化学 中村 正雄、津村 直美
　　アミロイドベータペプチド 　　　　　　　　　　の化学修飾解析 旭川医科大学教育研究推進センター 　　阿久津　弘明 化学　　　　　　　　　　　　　　　 　　中村　正雄、津村　直美

2 はじめに 認知症のひとつアルツハイマー病（AD）は脳への老人斑（SP）の蓄積が特徴である。ADの進行は、炎症や酸化ストレスとの関連が指摘されているが、その生化学的メカニズムは明らかではない。 SPは主にアミロイドβペプチド（Aβ）1- 42およびAβ1- 41から構成されており、また高濃度の鉄、銅と亜鉛が含まれている。凝集または繊維化したAβおよびオリゴマーAβの毒性発現により神経細胞が障害を受けると考えられている（アミロイド仮説）。また、SPより採取されたAβにメチオニン残基（Met35）の酸化も確認されている。

3 脳内ではミクログリアがAβを貪食し分解する事がわかってきた。また、ミクログリアに存在するMyeloperoxdase(MPO)は過酸化水素と周囲の塩素イオンから次亜塩素酸を産生する。 Aβはこの次亜塩素酸により化学修飾を受けると考えられる。本研究では、次亜塩素酸とAβとの反応に焦点を当ててMALDI/MSおよびLC/MS/MSを用い構造変化の検討を行った。

4 Amylpid β Asp- Ala- Glu- Phe- Arg- His- Asp- Ser- Gly- Tyr-
Glu- Val- His- His- Gln- Lys- Leu- Val- Phe- Phe- Ala- Glu- Asp- Val- Gly- Ser- Asn- Lys- Gly- Ala- Ile- Ile- Gly- Leu- Met- Val- Gly- Gly- Val- Val- Ile- Ala 1 12 25 35 42

5 実験 5mMリン酸バッファー（pH7.4）中にAβ 1-42、
Aβ 1-12あるいはAβ 25-35を100μMに調製し、これに100μM 次亜塩素酸（NaOCl）を加え反応させCHCAをマトリッスとしMALDI/MSを用い測定を行った。さらに化学修飾の詳細を検討するため、10mM酢酸アンモニウム(pH7.7)でAβ 1-12およびAβ 25-35を2μMに調製し、20μM NaOClと反応させ直ちにLC/MS/MSを用いESI（+）にて経時的に測定を行った。この時オートサンプラの温度を20℃とし反応温度を一定にした。ターゲットのプリカーサーイオンには2価イオンを用いた。

6 実験 MALDI/MS system REFLEX III（ブルカー・ダルトニクス） LC/MS/MS system
NanoFrontier eLD(日立ハイテク) カラム MonoCap C18 Fast-Flow 0.05 x 150mm、 Monolith Trap 0.05 x 150mm（GLサイエンス） L-column2 C x 150mm、 Trap C x 5mm（CERi）

7 実験 LC条件 移動相 A溶媒：2% ACN in ギ酸 B溶媒：98% ACN in ギ酸 流量：200nL
　移動相 　　A溶媒：2% ACN in ギ酸 B溶媒：98% ACN in ギ酸 　　流量：200nL MonoCap C18 Fast-Flow 　B溶媒：15%（0分） → 35%（20分） L-column2 C18 B溶媒：25%（0分） → 50%（15分） オートサンプラー設定温度 　20℃

8 a, Aβ 1-42 b, Aβ 1-42 + NaOCl [M+H]+ [M+K]+ [M+H+16]+ [M-44]+ 4450
4470 4490 4510 4530 4550 4570 4590 m/z -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 r.i. [M+H+16]+ [M+K]+ [M+H]+ b, Aβ NaOCl a, Aβ 1-42 [M-44]+

9 a, Aβ 1-12 b, Aβ 1-12 + NaOCl [M + H]+ [M + K]+ [M -44]+ [M + 35]+
1380 1400 1420 1440 1460 1480 m/z -0.4 -0.2 -0.0 0.2 0.4 0.6 r.i. [M + K]+ [M + 35]+ [M + H]+ a, Aβ 1-12 b, Aβ NaOCl [M -44]+

10 a, Aβ 25-35 b, Aβ 25-35 + NaOCl [M + K]+ [M + H]+ [M + H+32]+
1020 1040 1060 1080 1100 m/z -0.50 -0.40 -0.30 -0.20 -0.10 -0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 r.i. [M + H+16]+ [M + H+32]+ [M + K]+ [M + H]+ b, Aβ NaOCl

11 Aβ 1-12 a1,TICC b1,m/z 712.80(M+H) c1,m/z 729.79(M+35)
d1,m/z (M-44) 6 12 18 24 30 Retention Time (min) 1.6E+5 10 20 40 50 60 70 80 90 100 % Intensity XIC (MS) ±0.1000 c1,m/z (M+35) XIC (MS) ±0.1000 T14.6 b1,m/z (M+H) XIC (MS) ±0.1000 T14.8 T18.8 T21.0 a1,TICC 1.8E+6 TIC (MS) T15.8 T17.5 T19.6 T20.3 T22.0 T23.9 T3.8 T24.9 T2.7 T25.6 T5.5 T4.7 T26.5 T6.2 T7.1 T0.8 T28.5 T12.6 T10.6 T1.3 T8.7 T11.8 T10.0 T9.3 T13.6 d2,m/z (M-44) 1.3E+5 T15.0 c2,m/z (M+35) T14.4 b2,m/z (M+H) T14.1 T16.2 T16.8 T18.5 a2,TICC 1.6E+6 T16.7 T18.0 T19.0 T20.1 T28.9 T21.2 T27.8 T3.4 T25.2 T22.4 T23.4 T4.2 T24.2 T7.3 T0.2 T0.9 T9.2 T2.5 T1.7 T7.8 T6.4 T8.3 T10.1 T10.9 T12.4 Aβ 1-12 Aβ NaOCl（4分後） M+35 M-44

12 Aβ 1-12 + NaOCl（4時間後） a3,TICC b3,m/z 712.80(M+H) c4,m/z 729.79(M+35)
6 12 18 24 30 Retention Time (min) 1.6E+5 20 40 60 80 100 % Intensity XIC (MS) ±0.1000 T15.0 XIC (MS) ±0.1000 T14.5 T17.0 T18.4 XIC (MS) ±0.1000 T14.2 T17.1 1.4E+6 TIC (MS) T17.6 T19.0 T19.7 T20.6 T3.9 T21.4 T12.3 T5.8 T1.7 T7.4 T2.3 T22.0 T0.5 T4.9 T8.4 T9.5 T11.5 T1.2 T13.5 T10.9 T10.1 T23.2 T25.6 T27.6 T24.5 Aβ NaOCl（4時間後） Aβ NaOCl（30時間後） b3,m/z (M+H) b4,m/z (M+H) a3,TICC a4,TICC c4,m/z (M+35) d4,m/z (M-44) Tyr+35 2.2E+5 T14.6 T17.9 T18.6 T20.2 T21.1 T22.7 T15.3 T14.0 T15.8 T16.4 1.1E+6 T16.6 T17.7 T20.5 T25.2 T29.1 T8.0 T22.9 T26.0 T7.1 T2.2 T10.8 T0.9 T3.8 T5.1 T28.1 T9.6 T12.0 T5.7 T26.8 T4.4 T8.7 T6.5 T3.1

13 Aβ 1-12 [M+H]+ a2 b9 a10 b7 b2 b8 b5 b6 b3 a6 b11 y3 a11 b4 b12 100
380 660 940 1220 1500 m/z 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Y a2 b9 a10 b7 b2 [M+H]+ b8 b6 b5 b3 a6 H b11 a11 y3 E b4 b12 Aβ 1-12

14 Aβ 1-12 + NaOCl 同位体パターン [M+35]+ y5 a2+34 b2+34 b3+34 b5+34 b7+34 b6+34
100 380 660 940 1220 1500 m/z 10 20 30 40 50 60 70 80 90 a2 a3 b2 y5 a2+34 b2+34 b3+34 b5+34 b7+34 b6+34 a6+34 b9+34 b8+34 b11+34 b10+34 a10+34 y1 y3 y2 [M+35]+ Aβ NaOCl 1014.0 1030.8 1047.6 1064.4 1081.2 1098.0 同位体パターン

15 Aβ 1-12 + NaOCl [M-44]+ b7-45 b9-45 b2-45 y1 b8-45 a10-45 b6-45 b3-45
100 380 660 940 1220 1500 m/z 10 20 30 40 50 60 70 80 90 [M-44]+ y1 b6-45 b7-45 b9-45 b8-45 a10-45 b10-45 b5-45 b3-45 b2-45 Aβ NaOCl

16 Aβ 1-12 + NaOCl [M+35]+ b2 a2 a10+34 b10+34 b11+34 b9 b7 b5 b8 a3 100
380 660 940 1220 1500 m/z 10 20 30 40 50 60 70 80 90 a2 b9 b7 b8 b5 a3 a10+34 b10+34 b11+34 b2 Aβ NaOCl [M+35]+

17 a, Aβ 25-35 b, Aβ 25-35 + NaOCl [M+H]+ [M+H+16]+ +16Da b10 y3 y1 y4 b8
100 320 540 760 980 1200 m/z 10 20 30 40 50 60 70 80 90 b10 [M+H]+ y3 y1 y4 b8 b7 b9 y5 b4 y2 y7 a11 b3 b5 b6 a10 b11 y1+16 y2+16 y3+16 y4+16 y5+16 [M+H+16]+ +16Da a, Aβ 25-35 b, Aβ NaOCl

18 結果 MALDI/MSによる測定ではAβ 1-42はNaOCｌとの反応で16Daの増加および44Daの減少を示した（図2）。Aβ 1-12では35Daの増加および44Daの減少（図3）。Aβ 25-35では16および32Daの増加が（図4）観測された。 今回測定に用いたLC条件ではAβ 1-42は難溶で、LCの配管やトラップカラムを詰まらせてしまったため、Aβ 1-41のN端またはC端側であるAβ 1-12およびAβ 25-35を用い経時的に測定を行った（図5a、図5b）。Aβ 1-12ではNaOCｌとの反応直後から[M+35]+のピークが増加し（図5a-c2）、4時間後

19 最大となった。反応直後僅かだが[M-44]+のピークも確認できた。 [M-44]+のピークは経時的に強度を増していった（図5b-d3、d4）。それぞれのピークをMS/MS測定した所、[M+35]+のピークのプロダクトイオンスペクトルからy系列イオンには変化は見られなかったが、bおよびa系列のイオンには+35Da増加が見られた（図7a）。 また、b系列イオンの同位体パターンから塩素の付加が確認できた。この事よりN端末のアミノ基が塩素化された事が確認できた。 [M-44]+のピークも同様に検討した結果（図7b）、bおよびa系列の各イオンから45Daの減少が観測された（図7b）。この事より1番目のAspからの

20 脱炭酸が確認できた。反応が進むと[M+35]+のピークが二峰性になる事が確認できた（図5b-c4）。
MS/MS測定の結果、b10およびa10以降のイオンに34Daの増加が観測された（図8）。この事より 10番目のTyrが塩素化された事が確認できた。 同様にAβ 25-35についても検討した。[M+H+16]+のピークのプロダクトイオンスペクトル（図10）を見ると、b系列のイオンには変化がなく、y系列のイオンは16Daの増加が観測できた。この事より10番目のMetの酸化が確認できた。なお、今回の条件ではMALDIで観測できた[M+H+32]+のピークは観測できなかった。

21 まとめ Aβ 1-12と次亜塩素酸の反応では、初めにN末のアミノ基と次亜塩素酸が反応し、次いでAspの脱炭酸が起きる過程を推論できた。さらに反応が進むとTyrへの塩素化が起きる事も確認できた。Aβ 1-42やAβ 25-35は次亜塩素酸と高い反応性を持つMetを有しているため優先的に酸化されたと考えられる。 今後塩基性溶媒を用いたAβ 1-42のLCによる分離条件を検討し、Aβ 1-12との比較検討を行いたい。