遺伝子の解析 第１弾 DNAについて＆PCR法

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1 遺伝子の解析 第１弾 DNAについて＆PCR法

2 ＤＮＡ（Ｄｏｅｘｙｒｉｂｏ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）
遺伝子とは？ ＤＮＡ（Ｄｏｅｘｙｒｉｂｏ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　　　　　　　　　　　　　　　　　Ａｃｉｄ） ２本の鎖がお互いに絡まりあったような構造 規則正しく螺旋状になっている構造 前に進むにつれて右巻き（時計回り）に回る構造 二重螺旋構造double helix １回転（ピッチ）で３４Å＝１０base

3 ヌクレオシド〔nucleoside〕 とヌクレオチド〔nucleotido〕
　二重螺旋構造の各々の鎖はヌクレオチドという単位の繰り返し（重合）でできています。 アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）というプリン塩基、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）というピリミジン塩基にデオキシリボースという五単糖が結合したものをヌクレオシドといい、さらにリン酸が結合したものをヌクレオチドという。 ５´ １´ ２´ ３´ ４´ 糖Sugar ＋ Ｐ リン酸Phosphate A T G C 塩基Base ＝ ヌクレオチドＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ヌクレオシド

4 ＤＮＡの模式図 水素結合 ３´末端 Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ ５´末端 T A Ｇ A A Ｃ Ｃ T Ｃ T T Ｇ A Ｇ ５´末端

5 ＤＮＡについてのまとめ 細胞核（ミトコンドリアにも全ＤＮＡ量の約0.1～0.2％を含む） どこにあるのか？ 何をしているのか？
ＤＮＡについてのまとめ　 細胞核（ミトコンドリアにも全ＤＮＡ量の約0.1～0.2％を含む） どこにあるのか？ 何をしているのか？ 遺伝情報の伝達 ２本のポリヌクレオチド鎖が、A-T、G-Cの水素結合による塩基対を形成し、１０対を一巻きとする、右巻きの２重らせん構造。 どのような構造か？ １、ＤＮＡのA/T比、G/C比はほぼ１。 ２、（A+T）/（G+C）の比は生物種により固有。 0.35～2.70の値をとる。ヒトでは1.52、酵母では1.79、大腸菌では0.95。 ３、ＤＮＡの分子量は数百万以上。ヒトでは細胞１個あたり約５～６pgのＤＮＡを含む。 その他

6 ＤＮＡの変化 ＤＮＡは加熱（通常７０℃以上）によりdouble helixがほどけてランダムコイルになる。これを変性（denaturation）または融解（melting）という。 変性が進むにつれて紫外吸収（２６０ｎｍの吸光度）が増大し、完全に変性すると４０～５０％の吸光度変化が見られる。これを濃色効果（hyperchromic effect）という。 ５０％の変性が起こる温度を融点（Ｔｍ：midpoint temperature）という。水素結合が３対あるG-C結合は、２対のA-T結合より安定なのでG-C結合が多いほどＴｍは高い。 変性したDNA溶液を冷却すると、相補的な鎖はひとりでに結合して元の2本鎖に戻る。これをアニーリング（焼きなまし）という。

7 ＰＣＲ（Polymerase chane reaction）法
ＰＣＲ法とは？ ステップ１（Denaturation：熱変性）、ステップ２（ annealing：焼きなまし）、ステップ３（Extension：伸長反応）の３ステップを１つのサイクルとして１つのテンプレート（鋳型）DNAから２つの複製を作り出し、この反応を何サイクルも行うことでDNAを指数関数的に大量に増幅させる方法 ＰＣＲ産物の生成量（log） サイクル数 指数増幅期

8 PCR産物の増幅 ・・ ・・・・ ・・・ ２５サイクル行うと２ 個 ３３,５５４,４３２個 Ex) n ２ 個 ２個＝２ 個 ４個＝２ 個
プライマー 　　１サイクル終了時 ２個＝２ １ 個 ２サイクル終了時 ４個＝２ ２ 個 ５´ ３´ スタート時 １個＝２ ０ 個 ２５サイクル行うと２ ２５ 個 ３３,５５４,４３２個 Ex)

9 PCRの各ステップについて ステップ１（熱変性：denaturation）
まず93～95℃に加熱することにより二本鎖になっている、テンプレート（鋳型）となるＤＮＡを引き離しプライマー（ＤＮＡを酵素的に合成する際に使われる２０～３０塩基対の短いＤＮＡ断片。 増やしたい部分の両端に結合する塩基配列を持つ。）がテンプレートに結合できるような状況をつくる。 ５´ ３´ テンプレートＤＮＡ

10 テンプレートＤＮＡ ５´ ３´ 加熱（９３～９５℃） ５´ ３´

11 ステップ２（アニーリング： annealing）
５´ ３´ ５´ ３´ ステップ２（アニーリング： annealing） それぞれの一本鎖の相補的な部分にプライマーが二本鎖を形成 できる（annealing）温度まで冷却し、伸長反応が起こるようにする。 ５´ ３´ ３´ ５´ プライマー ５´ ３´ ５´ ３´ 冷却（５０～６０℃）

12 ３´ ５´ ３´ ５´ ３´ プライマー ３´ ５´ 冷却（５０～６０℃） G G T G C C C C C A C G G G T C

13 ステップ３（伸長反応： Extension ）
プライマーを起点として耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ酵素により５´ から３´方向にＤＮＡ合成が起こり、ＤＮＡの２本鎖が作られる。 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ 完成

14 ＤＮＡ鎖の伸長反応（５´→３´へ向かう） OH DNAポリメラーゼにより次のTに相補的な が選ばれ、３´末端の-OH基が
プライマー ５´末端 ３´末端 A T Ｇ Ｃ Ｐ OH テンプレートDNA DNAポリメラーゼにより次のTに相補的な P A A ３´末端 が選ばれ、３´末端の-OH基が ５´末端のリン酸基とホスホジエステル結合する 新しくできた部分 ３´末端 T Ｇ Ｃ A Ｐ OH ５´末端

15 PCR法の臨床応用 結核菌、その他の細菌検査 HCV核酸定性、定量検査 ミトコンドリア病の診断
非侵襲的出生前診断（母体血中を循環している胎児細胞を用いる） 染色体異数診断 などなど・・・・・・ 参考文献など 改訂　遺伝子工学実験ノート（羊土社）　改訂第２版　生化学ガイドブック（南江堂） 遺伝子の部屋　　

16 DNAシークエンス （ABI PRISM３１０を用いて遺伝子の配列を読む）
原理 オートシークエンサー（ABI　PRISM３１０）のための反応では合成されるDNAを蛍光物質で標識します。このDNAを電気泳動し、泳動中にレーザー光を当て励起光を自動で検出し、コンピューターで解析します。 Coming Soon ABI　PRISM３１０について 　　ABI　PRISM３１０でのシークエンス反応はサイクルシークエンス法とよばれる方法で行っています。まず、PCR反応でA,G,C,Tそれぞれに、励起する波長が異なる４種類の蛍光色素をｄｄNTPにつける方法（Dye　Terminator法）を用い、その標識されたDNAフラグメントを内径５０μｍのキャピラリー管のなかで電気泳動を行いA,G,C,Tそれぞれの蛍光をCCDカメラで検出し、塩基配列を読むことができる。