2つの抗タクロリムス抗体を使用するタクロリムスのサンドイッチアッセイ T.Q. Wei, Y.F. Zheng, M. Dubowy, and M. Sharma April 2014 www.clinchem.org/content/60/4/621.full © Copyright 2014 by the American Association for Clinical Chemistry

序論 – なぜ、サンドイッチアッセイか? 競合免疫測定法 (IAs) は通常、タクロリムスの選択フォーマットである 理由:ハプテン薬物における、2つの抗体結合間の立体障害を避けることの難しさ 競合IAsを超えたサンドイッチの利点 分析感度が良い: 過剰な抗体 (Abs) 試薬デリバリーや温度変化に反応しにくい 特異性が良い: 代謝産物交差反応が低い 薬物アッセイにとっては重要

序論: サンドイッチアッセイは可能か？ C32 C22 14H04 Immunogen: Tacrolimus linked to KLH via C22 1E2 Immunogen: Tacrolimus linked to KLH via C32 Figure 1. タクロリムス 2D (左) と 3D (右) 構造. タクロリムスは分子量804Daのハプテン薬物である. 14H04と1E2のイムノゲンは、各々、C22とC32位に結合された. C22とC32は、2D構造と3D構造に分けられている. 2つの結合間の10炭素隔離が、2つの抗体がタクロリムスの2つの異なったエピトープを認識させた.

質疑 ハプテンサンドイッチアッセイのイムノゲンを作る、最もよい方法はありますか？

材料と方法: エピトープマッピング タクロリムス修飾と結合抗体測定 8つの代謝産物と3つの合成類似体 　炭素骨格上の1つの位置に、化学的修飾を行う結果としての結合ロスは、その修飾がその薬物の基本的な3D形を変えない場合、その部位が結合部位であることを示す。 8つの代謝産物と3つの合成類似体 　化学的修飾 vs. 抗体結合変化（交差反応）が分析された。 結合部位をつなぐことでエピトープを引き出す 　1E2と14H04抗体にとって

方法: 代謝産物/類似体の抗体結合. 表 1. 2つの競合アッセイによって測定された代謝産物と合成類似体の交差反応 方法: 代謝産物/類似体の抗体結合. 表 1. 2つの競合アッセイによって測定された代謝産物と合成類似体の交差反応. サンドイッチフォーマットで使用された2つの抗体のそれぞれは、各競合アッセイに用いられた抗体であった. それらの結合部位（エピトープ）は、化学反応基の修飾による結合のロスが、その部位、もしくは近くに位置する結合部位であるという前提に基づいて、交差反応データから推定された

方法: 代謝産物と類似体 (2D) 図 2. タクロリムス代謝産物と、合成類似体の2D構造

Tacro M - VIII Tacro 15,31 O-Didesmethyl Tacro 13,15 O-Didesmethyl Tacro 13,31 13 O Demethyl Tacro 24 succinate 32 22 Oxime 15 31 12 Hydroxyl Tacro 方法: 代謝産物と類似体 (3D.) 図 3. タクロリムス代謝産物と合成類似体の3D構造 。代謝産物VIIIを除いて、 残りの化合物は基本的な3D構造を保持した. そのタクロリムスから3D形におけるわずかな曲りは、ジメチル化、ヒドロキシル化、サクシニル化、オキシム複合が起こった部位で観察された。 炭素原子は灰色ボール、酸素が赤色ボール、窒素は青ボールで示されている.

方法: エピトープマッピング 13 15 31 32 12 22 24 Binding site for 1E2 Binding aid site for 1E2 Binding site for 14H04 Binding aid site for 14H04 図 4. タクロリムスの14H04と1E2の推定されたエピトープ. 1E2にマップされた結合と結合補助部位は、それぞれ太い青い囲いと薄い青い囲いで描かれ、14H04のそれらはそれぞれ太い黒い破線囲いと薄い黒い破線囲いで描かれている

質疑 先のスライドにおける、エピトープ分析の弱点は何でしょうか?

方法: サンドイッチ予測 A B 図 5. タクロリムスを用いた2つの抗体のサンドイッチフォーメーション. A: 左の3D構造の時計回りスピニングは、右側の3D構造を得て、1E2（太い青い囲い）における結合部位が14H04（太い破線黒い囲い）の結合部位から立体的に分かれていることを示す. B: 推定されたエピトープの空間的配列をベースにした2つの抗体に。FK506の同時結合の推定図. 図は2つの抗体が2方向から薬物に接近している予測を描いている.

結果: サンドイッチ立証 図 6. ELISAによるサンドイッチフォーメーションの立証. A: サンドイッチはタクロリムスの有無で、キャプチャとして14H04、タグとして1E2、もしくは14H04を使用することで、1分間あたりミリ単位で結果を得る; B: タクロリムスの有無で、キャプチャとして1E2、タグとして14H04、もしくは1E2を使用したときの結果.

結果: ACMIAによる曲線と精度 図 7. ACMIAサンドイッチアッセイとHPLC-MS/MS法の比較. A: 用量反応性曲線 結果: ACMIAによる曲線と精度 図 7. ACMIAサンドイッチアッセイとHPLC-MS/MS法の比較. A: 用量反応性曲線. B: 本アッセイとHPLC-MS/MSの方法比較. C-E: 0-7, 0-20, 20-30 ng/mL におけるバイアスとHPLC-MS/MSのブランド-アルトマンプロット.

結果: サンドイッチアッセイのパフォーマンス. 表 2. タクロリムスサンドイッチアッセイのパフォーマンス特性 結果: サンドイッチアッセイのパフォーマンス. 表 2. タクロリムスサンドイッチアッセイのパフォーマンス特性. a WBP1-3 = whole blood pool from transplant patients. b WPB4= whole blood pool from non-transplant patients spiked with tacrolimus powder. c Five whole blood samples from transplant patients were used for each of the studies. d Substance concentration shown is the final concentration in the sample except for bilirubin which shows the concentration of spike.

結果: サンドイッチアッセイの特異性. 表 3. 代謝産物と合成類似体の交差反応 結果: サンドイッチアッセイの特異性. 表 3. 代謝産物と合成類似体の交差反応. ACMIAサンドイッチアッセイによって予測、測定された交差反応は、2つの競合アッセイで測定されたものと比較される. サンドイッチ交差反応予測は14H04と1E2の交差反応の掛け算で作られた.

質疑 サンドイッチアッセイにおいて、予測された交差反応を示さない15-O-デスメチルタクロリムスの可能な説明は何ですか?

要約 イムノゲン結合間の分離 2つの抗体にとって可能な2つの異なったエピトープを作 製 サンドイッチアッセイを予測した交差反応 2つの抗体にとって可能な2つの異なったエピトープを作　　製 サンドイッチアッセイを予測した交差反応 ELISAとACMIAはサンドイッチフォーメーションを確立した サンドイッチアッセイは、高い特異性を示した 薬物代謝産物と類似体での低い交差反応_________________________________________________ Reference: Werena Gounden and Steven J. Soldin. Tacrolimus Measurement: Building a Better Immunoassay. Clin Chem 2014; 60: 575

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