ＳＮＰを用いたホールゲノム 疾患感受性遺伝子探索 ～関節リウマチでの経験と花粉症への展開～ 平成17年9月21日 国立病院機構　相模原病院 集談会 京都大学医学研究科付属ゲノム医学センター 理化学研究所遺伝子多型研究センター 山田　亮

内容 連鎖不平衡マッピングの基礎 連鎖不平衡マッピングの実際 関節リウマチと花粉症

連鎖不平衡マッピングとは 遺伝子多型を用いた、 ケース・コントロール解析と、 ケース内フェノタイプ別関連解析は、 すべて 「連鎖不平衡マッピング」 の一部です

連鎖不平衡マッピングとは 遺伝子多型を用いた、 ケース・コントロール解析と、 ケース内フェノタイプ別関連解析は、 すべて 集団　と　集団　との比較 遺伝子多型を用いた、 ケース・コントロール解析と、 ケース内フェノタイプ別関連解析は、 すべて 「連鎖不平衡マッピング」 の一部です ゲノムＤＮＡの解析

連鎖不平衡とは 「連鎖」が 「平衡」に 達していない 連鎖不平衡とは 「連鎖」が 「平衡」に 達していない いつかは「昔」からの連鎖は崩れて、「平衡」に達する

連鎖と独立 形質は遺伝する 形質Aと形質Bの伝わり方は、 独立　か 連鎖しているか のどちらかである。

連鎖 Linkage 同一染色体上に存在する２つのローカスは親から子へ伝わるときに、一緒に伝わる。これは、２つのローカスが異なる染色体上にあるときには見られない現象である。 このような２遺伝子が遺伝上、挙動を共にするときに、２遺伝子は連鎖していると言う。 したがって、ある遺伝子とある遺伝子は、連鎖の関係にあるか、独立の関係にあるかのどちらかに属する。

連鎖の束の単位 「多数ある遺伝子は、それぞれが“ばらばら”に存在しているわけではなく、(ヒトならば)23個に束ねられている」

連鎖＋組換え 「多数ある遺伝子は、それぞれが“ばらばら”に存在しているわけではなく、(ヒトならば)23個に束ねられている」 「束」に変化がなければ、遺伝解析は23個を相手にすればよいのだが・・・

組換えは起きたり起きなかったり 組換え体

組換え ヒトでは、男女・ゲノム全体での平均が1.22cM/Mb ヒトゲノム30億塩基対(3000Mb) (The Sequence of the Human Genome by J. Craig Venter et al., Science) ヒトゲノム30億塩基対(3000Mb) 3000Mb ->36.6 組換え/1減数分裂 1.22 x 10-2 x 3000 = 36.6

連鎖不平衡とは 「連鎖」が 「平衡」に 達していない 連鎖不平衡とは 「連鎖」が 「平衡」に 達していない いつかは「昔」からの連鎖は崩れて、「平衡」に達する

世代を積み重ねると連鎖が途切れる 組換えがおきることにより、同一染色体上の遺伝子は、「必ず」一緒に伝達されるわけではない。 →　「必ず」一緒に伝達される遺伝子セットは？ →　組換えが起きても分断されないこと →　歴史の結果 　　・・・連鎖不平衡

連鎖不平衡 家系(2-5代)ではなく、集団(>数十代)を対象にするときには、連鎖不平衡ブロックが「伝達」追跡の単位

遺伝子の伝達の単位は、染色体ではなく、それが分割された「連鎖不平衡ブロック」 100世代 300世代 500世代 1000世代 スタート2人、交差率1/10^8bp回、1000SNP、定常5000人（10000hap)、出力1000人、変異率1/10＾6bp回 Maf>5%のみ 遺伝子の伝達の単位は、染色体ではなく、それが分割された「連鎖不平衡ブロック」

染色体全体で考えると、親子関係は複雑(複数の祖先がいる）だが、部分的には、単純(祖先は1つ) 組換え体 染色体全体で考えると、親子関係は複雑(複数の祖先がいる）だが、部分的には、単純(祖先は1つ) 染色体5’端 染色体中央部 染色体3’端 000 111 000 111 000 111 000 001 001 011 111 000 001 001 011 111 000 001 001 011 111

塩基配列DNA(String of SNPs) 時間経過 集団 100 SNPs 5 generations 1->2->4->7->5 chromosomes (0+1+1+4)=6 recombinations 青●→赤●にて感受性変異が生じたものとし、赤●は伝達された感受性変異を表す

疾患遺伝子解析は・・・ 集団の遺伝子伝達は、 疾患関連遺伝子検出は、 祖先から現代人への伝達の「木」 ゲノムは「木」が並んだ「林」 疾患リスクを上げる「木」を「林」から見つけ出すこと

単一遺伝子病　家系

木を見つける

複合遺伝性疾患 マーカーの木は存在する

木の葉の部分が不確実 ペネトランスが低い Phenocopyが存在する ・・・別の木が邪魔をする ・・・民族が代わると、森の枝ぶりが変わる

歴史の経緯によっては、 「多型」は断絶する 時間経過・世代経過(11代) 染色体 赤〇は着目変異の祖染色体とその変異を継承した染色体。 〇と〇をつなぐ線は染色体の親子関係。 黒丸の親子関係は省略してある。

連鎖不平衡 相互に連鎖の関係にある２つの多型の間に存在しうる関係。 ある２つの多型が同一の染色体上にあるとき、この２つの多型は「連鎖」している。 この２多型間で組換えが起きなければ、２多型のアレルの組み合わせは１つしかなく、片方の多型のアレルがわかればもう片方のアレルも自動的に決まる。 この２つの多型が発生して後、時間が経過するにしたがって、２点間には、組換えが繰り返し起きる。 「十分に多数回」組換えが起きると、片方のアレルがわかってももう片方のアレルは全く予想できない。 片方のアレルからもう片方のアレルの予想がつく関係を「連鎖不平衡」の関係にある、といい、予想が全くつかない関係を「連鎖平衡」の関係にある、という。 連鎖不平衡は、「連鎖」関係にある多型において、その間におきた組換えの歴史を反映したものとなる。また、「組換えの歴史」は個々の染色体が持つものではなく、集団が持つものであるから、「連鎖不平衡」はある「集団」の「２つの多型」の間に存在するものである。

染色体全体で考えると、親子関係は複雑(複数の祖先がいる）だが、部分的には、単純(祖先は1つ) 組換え体 染色体5’端 染色体中央部 染色体3’端 000 111 000 111 000 111 000 001 001 011 111 000 001 001 011 111 000 001 001 011 111

疾患遺伝子マッピング ゲノム探索をするための、地図の作成 地図には、多型マーカーを配置 広範囲スクリーニングデータからの候補領域同定 領域のFine mapping 標的領域の原因バリアント探索 複数多型の複合効果 同一遺伝子内複数多型 遠位ローカス間の複合効果

疾患感受性遺伝子の探索 疾患形質と関係のある遺伝子の探索とその生物学的根拠の解明 遺伝コード情報の差異の探索 個体・状態における遺伝子の働きの差異の探索

(病的状態において特徴的な役割を果たす遺伝子) 疾患関連遺伝子とは 全遺伝子 疾患感受性遺伝子 (DNAに刻まれたもの） 疾患病態関連遺伝子 (病的状態において特徴的な役割を果たす遺伝子) 疾患関連遺伝子 トランスクリプトーム・プロテオーム 疾患感受性多型を有する遺伝子 ゲノム・多型

Two Ways of Whole Genome LD Mapping 9 8 7 6 5 4 1 2 3 Gene-based Approach Map-based Approach Gene A Gene B Gene D Gene C

Gene-based Approach 関節リウマチ

遺伝子のカバー率 SNPもしくはblockによって、一部でも検証された遺伝子の数 12,890 （60.9%） 5.0±6.4 個/遺伝子 0.2±0.3 個/kb 常染色体総遺伝子数：21,153 カバーされず 8,263 8,381 12,890 Blockでカバー 4,509 SNPでカバー

LDマッピングの結果 ブロックを構成するSNP数 5.6±6.5個 ブロック数およびブロック平均長 7,875個、28.1±69.6ｋｂ A C G T G G T C A C T C A C G T A C T C G G T C A G G C G G G C A A C G C T A C G C G G T G ブロックを構成するSNP数 5.6±6.5個 ブロック数およびブロック平均長 　　 7,875個、28.1±69.6ｋｂ ブロックあたりのハプロタイプ（>5%) 数 2.6±1.0個 ブロックあたりのhtSNP数 　 1.6±0.9個

全染色体への分布

Identification of rheumatoid arthritis-associated PADI4, SLC22A4/A5, FCRL3 & PTPN22

Major findings from SNP-based studies PADI4 : RA Post-translational enzyme to produce targets of the most RA-specific autoantibodies. SLC22A4 /A5 : RA & Crohn Ergothioneine or carnitine transporter expressed in hematologic lineages. FCRL3 : RA, SLR & AITD Fc receptor homolog on B-cell membrane PTPN22 : T1DM, SLE, RA & AITD Lymphoid-specific intracellular phophatase

ＰＡＤＩ４ Ca2+-dependent post-translational modification C=NH2 + NH2 CH2 HCNH3+ COO- NH C=O Arginine Citrulline PADIs Loss of ionic NH2+ of Arg residue Effects on intra- and inter- molecular interactions

PADI4 Citrullination Antigenicity この部分だけ！

Association Plots in the PADI Cluster -log10(P)＝５

Enzyme substrate

Hypothetical mechanism of RA-susceptible variant

Chromosome 5q31 IL3, IL4, IL5, IL9, IL13, CSF2, IRF1 and TCF7 are in the region 　Recessive association 　Relative Risk = 2

The SNPs associated with RA or Crohn disease 10kb RIL SLC22A4 SLC22A5 IRF1 Genes Caucasian Japanese Exons Crohn Psoriatic Arthritis SLC22A4遺伝子のSNP：リウマチとの関連とクローンとの関連 RA & Crohn SNPs Heat shock element-binding site RUNX1 binding site L503F Tokuhiro, S. et al. Peltekova, V. D. et al. Barton, A. et al.

Ethnic difference in allele frequency of disease-related SNPs IRF1 RIL SLC22A4 SLC22A5 10kb Genes Exons SNPs intron1 intron2 Leu→Phe promoter (slc2F2 ) (slc2F1) SNP1 　　0.29　 0.09　　0.04 <0.00001§ 0.064* <0.00001§ 0.12* 0.14 0.012 SNP2 　　 0.29 0.09 　 0.04 <0.00001§ 0.066* <0.00001§ 0.12* 0.14 0.012 SNP3 0.001 0.39　　0.04 <0.00001§ 0.24* <0.00001§ 0.018 <0.00001§ 0.19* SNP4　　 0.001 0.52　 0.58 <0.00001§ 0.35* <0.00001§ 0.40* 　<0.00001§ 0.0038 J vs. C J vs. A C vs. A 　　 J 　　C 　 A　 P value FST P value FST P value FST §P<0.01, ＊FST> 0.05 Mori, et al. J Hum Genet 2005 May 10

Japanese Caucasian 0W0 1M0 0W0 1M0 0M1 1M1 Assumption of common responsible variant Japanese Caucasian 0W0　1M0 0W0　1M0 0M1 1M1 Segregation

FCRL3 Fc Receptor-like 3 Transmembranous protein （734aa) FcγR homolog ６ Ig-like domains outside Multiple tyrosin motifs (ITAM, ITIM, hemi-ITAM) Expressed by B cells in germinal centers

FCRL3 and others in 1q21-23 マウス ヒト FcγRI FCRL1~5 CD1 FcγRII/III CD3Z CIA（Mcia2) 1q21 mCh3 1q23 mCh1 EAE,TMEVD (Eae3, Tmevd2) Psoriasis Multiple sclerosis NOD (Idd10, Idd17) SLE Lupus models (sle1, swrl1) RA

NFkB regulates FCRL3 expression Binds C > T

Lymphoid organs and B cell- specific expression

Expression of FCRL3 in lymphocyte aggregates in RA synovial tissue B-cell CD20 100x T-cell CD3 100x FCRL3 Antisense 100x 400x

RAにおけるFCRL3の働き(仮説）

PTPN22 1p13 No Tryptophan (W) allele in Japanese 110kDa intracellular tyrosine phosphatase Functional SNP （1858 C->T, R620W) Positive association IDDM (Caucasian, Italian)　Bottini N et al. RA (Caucasian)　Begovich AB et al. SLE (Caucasian)　Kyogoku, C. et al. No Tryptophan (W) allele in Japanese

PTPN22 10kb Genes Exons SNPs Chromosome　1p13 Arg→Trp J vs. C J vs. A C vs. A 　　 J 　　C 　 　A　 P value FST P value FST P value FST SNP1 0.00 　 0.08 　0.02 <0.00001§ 0.040 0.00032§ 0.011 0.16 0.016 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　§P<0.01　 ＊FST >0.05　 Mori, et al. J Hum Genet 2005 May 10

自己免疫疾患感受性多型のオーバーラップ 根拠のはっきりした感受性遺伝子のみによる検討これらの相互関係を検討するところから

PADI4 PTPN22 RUNX1 SLC22A4/A5 Environmental Entry of Antigen Genetic Production of Antigen Transient Autoreaction Manifestation of phenotype Maintained Autoreaction Entry of Antigen Immune System Body Response to Antigen Presentation of Antigen Recognition of Presented Antigen From the Atlas of Renal Pathology American Journal of Kidney Diseases, Volume 32, Issue 1 Medical Encyclopedia PADI4 PTPN22 RUNX1 SLC22A4/A5

Anti-oxydant transporter MΦ Anti-oxydant transporter

Difference in allele frequency J　　　　　　 C　　　　　　 A Disease　　　Associated Population 　　　　　　　　　　　　　　　　　 RA　　　　　J　 　　 　 RA 　　　 　J　　 　 Crohn　　　 J Crohn C 　　 　　 　　 RA, SLE C　　　－ T1D http://office.microsoft.com/ja-jp/officeupdate/default.aspx RA, SLE　 J 　　 －　 T1D 　 PADI4　 SLC22A4/5 　 PTPN22 FCRL3

統計遺伝学 その取り扱い対象 集団遺伝学 数学モデル CoalescenceとRecombination 連鎖不平衡 集団比較遺伝学 ヒトの遺伝的歴史 Structure by J.Pritchard

母集団 ゲノムアプローチ疾患感受性多型 ケース対コントロール比較 非発病 発病 臨床病型分類 タイプ　１ タイプ　２ タイプ　３ タイプ　N ・・・ タイプ　A タイプ　B タイプ　C タイプ　X 治療反応性分類 ケース亜群 対 ケース亜群比較 同一ケース状態別比較 疾患亜分類関連多型 疾患亜分類関連指標

Nature Biotechnology 18 :1257 - 1261 (2000) 多数の遺伝子(DNA) 多様な転写調節(mRNA) 複雑な分子機能(タンパク質) さまざまな疾患 入り組んだ民族関係 A network of protein–protein interactions in yeast by Benno Schwikowski, Peter Uetz3 & Stanley Nature Biotechnology 18 :1257 - 1261 (2000)

Commmon diseasesとその遺伝性 遺伝的要因 環境的要因 偶然性要因 悪性腫瘍 単一遺伝子病 外傷 生活習慣病 リウマチ性疾患 アレルギー性疾患 イメージ 近代化環境の出現に伴う罹患率の急変化をきたしている疾患 感染症 淘汰圧の痕跡を残している疾患

関節リウマチ 花粉症 罹患率 5-20％ 遺伝性の詳細・・・ 罹患率の急上昇(1960年代より） スギ花粉症 日本スギ 罹患率～1％ 罹患率　5-20％ 罹患率の急上昇(1960年代より） スギ花粉症 日本スギ 遺伝性の詳細・・・ 罹患率～1％ １卵性双生児再発危険率 12~62 同胞再発危険率 2~17 HLA locus explains 1/3-1/2 of total genetic components. There are multiple non-HLA genes. PADI4 SLC22A4/A5 FCRL3 PTPN22

感受性遺伝子の報告 HLA class II Others HLA-D FceRIb 233 vs. 100 OR 1.89, 0.023 Eosinophil peroxidase 351 vs. 206 OR 2.14-22.4 <0.001 IL-4RA 351 vs. 206 OR 1.18-2.23, 1.48-5.46 <0.05 ADAM33 95 vs. 95 OR 4.81-1.66, 0.0002-0.022

東京大学医学部附属病院アレルギー･リウマチ内科 京都大学医学研究科付属ゲノム医学センター 松田文彦 千田昇平 平谷ひとみ 山口昌雄 廣澤 桂 理化学研究所遺伝子多型研究センター 関節リウマチ関連遺伝子研究チーム 山本一彦 鈴木亜香里 高地雄太 関根章博 角田達彦 中村祐輔 関節リウマチ臨床施設 国立病院機構相模原病院 當間重人先生　他 東京大学医学部附属病院アレルギー･リウマチ内科　 沢田哲治先生　他 京都大学医学研究科付属ゲノム医学センター 松田文彦 千田昇平 平谷ひとみ 山口昌雄 廣澤　桂 大東賢英