翻訳 5’ → 3’ の方向 リボソーム上で行われる リボソームは蛋白質とrRNAの複合体 遺伝情報=アミノ酸配列

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第 2 章 : DNA 研究法 2.2DNA クローニング クローニングベクター 大腸菌以外のベクター ゲノム分子生物学 年 5 月 7 日 担当 : 中東.
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序 論 生化学とは 生化学はbiochemistryという名で表したように簡単にいえば生命の化学である。ギリシャ語ではbiosは生命という意味である。つまり生化学は化学的理論と技術および物理学、免疫学の原理と方法を応用し、生体における化学構成と化学的変化を研究する学問である。
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翻訳 5’ → 3’ の方向 リボソーム上で行われる リボソームは蛋白質とrRNAの複合体 遺伝情報=アミノ酸配列 塩基3つで1個のアミノ酸に対応している →コドン 43= 64 とおり→遺伝暗号表 5’-A-U-G-G-C-U-G-G-C-U-U-A-A-C-G-C-G-U- 3’mRNA  Met Ala Gly Leu Thr Arg 50アミノ酸の蛋白質 →50×3=150塩基対のDNAにコードされている 5版 p.516 4版 p.521

遺伝コード表(Genetic Code) AUG(Met) →開始コドン 翻訳開始の目印 UAA, UAG, UGA →終止コドン  翻訳開始の目印 UAA, UAG, UGA →終止コドン  翻訳終了の目印 5’-A-U-G-G-C-U-G-G-C-U-U-A-A-C-G-U-A-A- 3’mRNA  Met Ala Gly Leu Thr stop 5版 p.517 4版 p.524

コドンとアンチコドン tRNAが,コドンと相補的な配列(アンチコドン)を介してコドンに結合し,コドンに対応したアミノ酸を結合する 5版 p.518 4版 p.525

タンパク質合成 リボソーム mRNA コドン 5版 p.519 4版 p.526

タンパク質合成 tRNAに結合したアミノ酸は、リボゾーム上で先に合成されたポリペプチド鎖のアミノ基と 反 応 してペプチド結合を形成する この反応は rRNAが触媒すると考えられている 5版 p.519 4版 p.526

5’CUU-AUG-GCU-UGG-CCC-UAA 3’ Leu-Met-Ala-Trp-Pro-stop 問題16・15 5版 p.519 4版 p.525(問題16・16) 5’CUU-AUG-GCU-UGG-CCC-UAA 3’ Leu-Met-Ala-Trp-Pro-stop マクマリー p. 525 No.42 (H12) イ M F Q Y ------------------- AUG UUU CAG UAC UCA ・・・ 4番目のUが欠失→フレームシフト M F S T AUG UUC AGU ACU CA ・・・ ウ 置換 GAA→UAA Glu stop 欠失 GUA A→UAA Val stop 置換,欠失のどちらの場合 でも生じうる(挿入の場合も) 正解は1番

制限酵素 制限酵素(restriction enzyme)は、 DNAの特定の塩基配列(4~8塩基対が多い)を認識して切断する酵素である。400種以上知られており、そのうち、約100種が市販されている。制限酵素は、ウイルスなどの外来遺伝子を切断して防御すると考えられている。自身のDNAは、同じ配列を認識するメチル化酵素によりメチル化して切断されないようにしている(制限修飾系)。  制限酵素の認識配列と切断箇所 ・ 6塩基認識   EcoRI 5’G|AATT|C3’       3’C|TTAA|G5’   PstI  5’C|TGCA|G3’          3’G|ACGT|C5’   BamHI 5’G|GATC|C3’          3’C|CTAG|G5’           (粘着末端) ・ 4塩基認識   HaeIII 5’GG|CC3’   3’CG|GG5’   AluI 5’AG|CT3’   3’TC|GA5’         (平滑末端) 5版 p.520 4版 p.527

DNAの配列決定法 5′---------TTGAAGCAGC--- DNAポリメラーゼ dATP,dGTP,dCTP,dTTP 3′---------AACTTCGTCG--- プライマー 5′---------T DNAポリメラーゼ dATP,dGTP,dCTP,dTTP ddATP,ddGTP,ddCTP,ddTTP 3′---------AACTTCGTCG--- T G A A G C A G C 5′---------T T ←ddTTP 伸長停止 5′---------T T ←dTTP ←ddGTP G 伸長停止 5′---------TTG A 5′---------TTGAA 5′---------TTGAAG 5′---------TTGAAGC 5′---------TTGAAGCA 5′---------TTGAAGCAG 5′---------TTGAAGCAGC これらの断片をキャピラリーゲル電気泳動により分離し,レーザー光を照射して各断片の蛍光を検出することにより配列を知ることができる 5版 p.520

DNAシーケンサー

PCR (Polymerase Chain Reaction) 2nd cycle forward primer 5′ 3′ template reverse primer dATP,dGTP,dCTP,dTTP DNA polymerase 変性(95℃) 二本鎖は解離して一本鎖となる 3rd cycle アニーリング(55℃) templateとprimerが二本鎖を形成 伸長反応(72℃) primerから相補鎖を合成 20-30 cycles 2n-n-1 nth cycle 5版 p.521 4版 p.530