烏骨鶏のミトコンドリア 全長塩基配列について 和田康彦１，２, 山田義之１,上平熊亘１, 西堀正英３,西堀奈穂子３,都築政起３, 安江 博４ １佐賀大学農学部、 ２BIRD,科学技術振興事業団 ３広島大大学院生物圏科学, ４生物資源研ゲノム研究
要旨 【目的】烏骨鶏は鶏の１品種であるが、その形態は他の品種とは大きく異なっているとともに、中国ではその肉が漢方薬として珍重されてきた。近年、わが国においても烏骨鶏の卵と肉は健康食品としての需要が高まってきているが、烏骨鶏の起源や他の鶏種との系統関係は明らかではない。そこで、烏骨鶏のミトコンドリアDNAの全長塩基配列を決定し、分子系統学的な解析を行った。 【方法】広島大学で維持されている烏骨鶏1羽の全血からDNAの抽出を行い、LA-PCRを用いて全長に近い長さのミトコンドリアDNAを増幅し、LA-PCR産物を用いてアガロース電気泳動を行い、ミトコンドリアDNAの位置のバンドを切り出して、DNAの精製を行った。精製したミトコンドリアDNAを鋳型にして24組のPCRを行い、PCRダイレクトシーケンス法を用いて烏骨鶏のミトコンドリアDNAの全長塩基配列を求めた。烏骨鶏、白色レグホーン、白色プリマスロック、ラオス在来鶏、日本ウズラのミトコンドリアDNAのD-loop領域の塩基配列から近隣結合法により分子系統樹を作成した。さらに、キジ科に属する6種7個体のＣytbおよびND2遺伝子の塩基配列を対比較して、サイト当たりの非同義置換数(dN)と同義置換数(dS)を推定した。 【結果】烏骨鶏のミトコンドリアDNAの全塩基数は16,784塩基で白色レグホーンより9塩基多い結果となった。ミトコンドリア全塩基配列における烏骨鶏と白色レグホーンの間の相同性は99.8%であった。近隣結合法により作成した分子系統樹において、今回シーケンスした烏骨鶏のD-loop領域の塩基配列は白色レグホーンときわめて近縁であることが示された。キジ科鳥類間のdN/dS比はcytb、ND2ともに0.1未満と小さく、シーケンス間の遺伝距離の増加とともにわずかに増加する傾向が認められた。
方法 烏骨鶏の血液からDNAを抽出 ２組のプライマーペアでＬＡ-ＰＣＲ ミトコンドリアＤＮＡのバンドを切り出し ２組のプライマーペアでＬＡ-ＰＣＲ ミトコンドリアＤＮＡのバンドを切り出し ミトコンドリアＤＮＡを鋳型に２４組のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ 確認されたＰＣＲ産物の精製とＰＣＲダイレクトシーケンス反応 精製したＰＣＲ産物の塩基配列の決定 各ＰＣＲ産物の塩基配列のアセンブル Ｄ‐loopの塩基配列のデータを用いた分子系統樹の作成 ＣｙｔｂおよびＮＤ２の塩基配列データを用いたｄＮ／ｄＳ比の推定
ＤＮＡサイト当たりの非同義置換数と同義置換数の推定 アミノ酸配列のアライメント 分子系統樹の作成方法 近隣結合法、ブートストラップ１０００回 ＤＮＡサイト当たりの非同義置換数と同義置換数の推定 アミノ酸配列のアライメント アミノ酸配列にもとづく塩基配列のアライメント 対比較による推定 (PAML3.13 codeml )
烏骨鶏のミトコンドリアＤＮＡの遺伝子構造とプライマー
D‐loop 領域の塩基配列による分子系統樹 （近隣結合法、ブートストラップ１０００回） 日本ウズラ 白色プリマスロック ラオス在来鶏 995 烏骨鶏 949 白色レグホーン
サイト当たり非同義置換数と同義置換数の割合（ｄＮ／ｄＳ） （ＮＤ２遺伝子領域、対比較） ＭＬ法 ＮＧ法 白色レグホン 烏骨鶏 ＮＡ コジュケイ 0.026 0.072 ヨーロッパヤマウズラ 0.061 0.114 コウライキジ 0.034 0.073 日本ウズラ 0.040 0.105 アメリカホシハジロ 0.003 0.136 0.025 0.060 0.113 0.033 0.039 0.137 0.049 0.111 0.041 0.099 0.029 0.081 0.145 0.059 0.092 0.122 0.018 0.147 0.058 0.103 0.057 0.148 0.150
遺伝距離とdN/dS比との散布図（ＮＤ２）
遺伝距離とdN/dS比との散布図（Ｃｙｔｂ）
系統樹の枝ごとのｄN/ｄS比の推定値（Cytb) 0.021 アメリカホシハジロ 0.011 日本ウズラ 0.042 コジュケイ 0.005 白色レグホン 0.008 烏骨鶏 0.031 0.050 ヨーロッパヤマウズラ コウライキジ 0.014 0.005
系統樹の枝ごとのｄN/ｄS比の推定値（ND2) 0.036 アメリカホシハジロ 0.038 日本ウズラ 0.035 コジュケイ 0.025 白色レグホン 0.056 烏骨鶏 0.211 0.078 ヨーロッパヤマウズラ 0.077 0.046 コウライキジ