Monitoring the Expression Pattern of 1300 Arabidopsis Genes under Drought and Cold Stresses by Using a Full-Length cDNA Microarray The Plant Cell, Vol.13, 61-72, January 2001 Motoaki Seki, Mari Narusaka, Hiroshi Abe, Mie Kasuga, Kazuko Yamaguchi-Shinozaki, Piero Carninci, Yoshihide Hayashizaki, and Kazuo Shinozaki

環境ストレスについて 植物の成長は環境ストレスに影響を受ける。 →植物はこれらのストレスに応答し、適応している。 Introduction 環境ストレスについて 植物の成長は環境ストレスに影響を受ける。 　　→植物はこれらのストレスに応答し、適応している。 その中でも乾燥・水不足は、植物の成長・作物の生産に最も厳しい制限要因となる。 　　→乾燥ストレスは様々な生化学反応や 　　　　生理学反応を誘導する。 　　例えば、光合成には水が必要であり、また気孔が閉じることにより、 　　ガス交換が妨げられるため、水不足は光合成能力を制限する要因となる。

環境ストレスに対する応答 タンパク質は色々な機能を持っており、状況に応じて合成され、機能している。→何が関わっているのか？ Introduction 環境ストレスに対する応答 タンパク質は色々な機能を持っており、状況に応じて合成され、機能している。→何が関わっているのか？ ストレス誘導性の遺伝子が転写されることで、　それに対応するタンパク質が合成され、　　　　　ストレス耐性が向上する。 この研究では、新たなストレス誘導性の遺伝子を同定することを目的とした。

研究の背景 プロジェクトによって、多くの生物の塩基配列などが決定されている。 Introduction 研究の背景 プロジェクトによって、多くの生物の塩基配列などが決定されている。 シロイヌナズナでは2000年の終わりに、全塩基配列が決定された。 今後は、これらのデータベースをもとに機能解析を行うことが重要である。

マイクロアレイについて Introduction 近年、遺伝子発現の解析にとって便利な方法として注目されている。 大多数の遺伝子発現の比較解析ができる。 (右図を参照)

目的とした遺伝子 乾燥誘導性遺伝子 (drought-inducible gene) Introduction 目的とした遺伝子 乾燥誘導性遺伝子 (drought-inducible gene) 低温誘導性遺伝子 (cold-inducible gene) DREB1Aの標的遺伝子 (target gene of DREB1A ) 　　DREB1A・・・DRE結合性タンパク質1A。低温に誘導される。 　　標的遺伝子・・・ある遺伝子によって発現調節を受ける遺伝子。 DREB1遺伝子群は低温に誘導されるが、乾燥・塩には誘導されない。 DREB1AにはDREB1B、DREB1Cという２つのホモログがある。 DREB2遺伝子群は乾燥・塩で誘導されるが、低温では誘導されない。 DREB2遺伝子群には、DREB2A、DREB2Bがある。

植物材料とストレス処理 シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana) ２２℃、３週間、発芽培地上で生育。 乾燥処理 低温処理 Method 植物材料とストレス処理 シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana) ２２℃、３週間、発芽培地上で生育。 乾燥処理 　　　温度２２℃、湿度60%、薄暗い 低温処理 　　　温度２２℃→４℃、薄暗い 　　それぞれの処理は2時間、10時間行った。 乾燥処理は、Whatman 3MM paper上で行った。

トランスジェニック(遺伝子導入)植物 生育条件は先程と同様 (22℃、3週間、発芽倍地上で生育) DREB1A遺伝子を過剰発現させた。 Method トランスジェニック(遺伝子導入)植物 生育条件は先程と同様　(22℃、3週間、発芽倍地上で生育) DREB1A遺伝子を過剰発現させた。 　→つまり、その標的遺伝子の発現量も多くなっていると考えられる。

マイクロアレイ解析の流れ Method それぞれのRNAを抽出 抽出したRNAを蛍光標識でラベリング ハイブリダイゼーション (Figure 2) それぞれのRNAを抽出 抽出したRNAを蛍光標識でラベリング 　　　(未処理をCy5〈緑〉、処理をCy3〈赤〉) ハイブリダイゼーション 　　　ラベリングして得られたプローブをチップ上にスポットしてあるcDNA(PCRの生成物)とハイブリダイゼーションをさせる。 チップをスキャナで取り込み、蛍光のパターンを見て、発現量を解析する。 RNA抽出；Isogen(RNA抽出試薬) を用いて抽出。 　　　　　その後、mRNAはOligotex-dT30 mRNA purification kit(精製キット)を使って準備 。 ラベリング；蛍光標識してある塩基中で逆転写させることによって行う。 プローブ；特定の塩基配列と高い相同性をもつDNAまたはRNA。 　　　　　マイクロアレイ実験では、蛍光標識したDNAプローブを用いてハイブリダイゼーションを行い、 　　　　　遺伝子発現を解析する。 チップ上のcDNA；PCRで増幅して得られたもの。今回のものはシロイヌナズナの完全長cDNAライブラリから単離したもの。 　　　　　再現性を確かめるために、それぞれチップ上に2反復。 　　　　　さらに、コントロールとして恒常的に発現している(ハイブリダイゼーションする)α-tublin遺伝子。→黄 　　　　　負のコントロール(ハイブリダイゼーションしない)nAChRE遺伝子。→黒(無)　(Figure 1参照) スキャニング；scanning laser microscope(model ScanArray4000; GSI Lumonics) を用いた。 　　　　　コントロール(未処理)と比べて、発現量が2倍のものを、目的の遺伝子とみなした。

スキャニング後の解析の例 赤→処理したほうが発現量が多い。 黄→処理と未処理で発現量に変化はない。 緑→未処理のほうが発現量が多い。 (Figure 1) 赤→処理したほうが発現量が多い。 黄→処理と未処理で発現量に変化はない。 緑→未処理のほうが発現量が多い。 黒→処理、未処理ともに発現していない。 チップ上のcDNA；PCRで増幅して得られたもの。再現性を確かめるために、それぞれチップ上に2反復。 　さらに、コントロールとして恒常的に発現している(ハイブリダイゼーションする)α-tublin遺伝子。→黄 　　　　　　負のコントロール(ハイブリダイゼーションしない)nAChRE遺伝子。→黒(無)　(Figure 1参照) スキャニング；scanning laser microscope(model ScanArray4000; GSI Lumonics) を用いた。 　　　　　コントロール(未処理)と比べて、発現量が2倍のものを、目的の遺伝子とみなした。

RNAゲルブロット解析 Northern blot 法を用いて、 抽出した全RNAの一部を解析。 Method 　　　　　→マイクロアレイの正確性を評価するため。 調べたい遺伝子に結合する相補的な配列を持ったDNAあるいはRNAプローブ液(今回はPCRで生成されたcDNA)を加えてハイブリダイゼーションを行うことにより、特定のRNAを検出する方法。 電気泳動を用いる手法。電気泳動によりサンプルRNAをゲル上で分子量に応じて分離し、目的のRNAと相補的な配列をもつ放射性標識したDNAあるいはRNA断片により、ゲル上での位置と量を同定する手法。プローブ液はPCRで増幅されたもの。

マイクロアレイの正確性(RNAゲルブロット解析) Result & Discussion マイクロアレイの正確性(RNAゲルブロット解析) (Figure 3) マイクロアレイのデータは、RNAゲルブロット解析においても妥当性が認められた。 マイクロアレイで新たに確認された　　　　6つのDREB1A標的遺伝子の発現は、　　　　乾燥・低温に誘導されており、無ストレス処理のトランスジェニック植物においても、過剰に発現していた。 Figure 3はマイクロアレイとRNAゲルブロット解析の比較。(新しいDREB1A標的遺伝子)

マイクロアレイで確認された遺伝子の数 Result & Discussion 遺伝子の種類 乾燥誘導性遺伝子 (Table 1) 遺伝子の種類 確認された数 そのうち 新しいもの 以前に報告されているもの 乾燥誘導性遺伝子 (drought-inducible gene) 44 30 14 低温誘導性遺伝子 (cold-inducible gene) 19 10 9 DREB1Aの標的遺伝子 (target gene of DREB1A ) 12 6 →今回のマイクロアレイが、ストレス誘導性の遺伝子を見つけるのに、 　適切に機能していることを示している。・・・以前に報告されたものも含むことから。 それぞれの数は重複を許している。つまり、乾燥誘導性遺伝子として確認されたもののうち、低温誘導性遺伝子として確認されたものもある。 →今回のマイクロアレイが、ストレス誘導性の遺伝子を見つけるのに、 　適切に機能していることを示している。

遺伝子の発現特性による グループ分け グループに分けられなかった遺伝子―21 (Figure 4, Table 2) (1) 乾燥誘導性＋低温誘導性→20 (2) 乾燥誘導性のみ→5→うち4つが新しい (3) 低温誘導性のみ→2→うち1つが新しい (4) 分類不可能(発現が弱い、バックグラウンドが高い)→21 グループに分けられなかった遺伝子―21

乾燥誘導性＋低温誘導性→20→うち9つが新しい 　　　・・・薄い紫(DREB1A標的遺伝子が12)と薄いオレンジ(DREB1A標的遺伝子ではないものが4つ) (2) 乾燥誘導性のみ→5→うち4つが新しい・・・濃い赤 (3) 低温誘導性のみ→2→うち1つが新しい・・・濃い青 (4) 分類不可能(発現が弱い、バックグラウンドが高い)→21・・・黒

新たに確認された遺伝子の同定 相同性検索(BLAST)を利用して、 新しく確認された遺伝子の同定を行った。 Result & Discussion 新たに確認された遺伝子の同定 (Table 2) 相同性検索(BLAST)を利用して、　　　　　　　　新しく確認された遺伝子の同定を行った。 遺伝子 相同性検索の結果 FL6-55(乾燥) LEA 76 type I protein (X91919) FL2-56(乾燥) glycine-rich protein 3 short isoform (GRP3S; AF104330) FL5-3J4(乾燥) Borrelia burgdorferi heat shock protein dnaJ (M96847) FL5-2D23(乾燥) T20517 EST FL5-90(低温) β-amylase (AJ250341)

DREB1A標的遺伝子について Result & Discussion (Table 3) 多くの遺伝子はDRE、　もしくはCCGAC配列を持っている。 　　　→これらの遺伝子は、ABA独立性経路によって　制御されている。 6つの遺伝子はABRE配列を持っている。 　　　→これらの遺伝子は、ABA依存性経路によって　制御されている。 ABA依存性、独立性、双方の経路によって発現が制御されているものもある。(6つ)

DREB1A標的遺伝子について →ストレス誘導性の遺伝子発現が、異なる制御 システムによって制御されている。 Result & Discussion DREB1A標的遺伝子について (Table 3) rd20は、ABREをプロモーターに含んでおり、ABA処理にも誘導されることから、ABA依存性経路によって制御されている。 DREB1A/CBF3は、低温特異的な遺伝子発現に関連する配列をプロモーターに含んでおり、ABA処理には誘導されない。つまり、ABA独立性経路によって制御されている。 →ストレス誘導性の遺伝子発現が、異なる制御　システムによって制御されている。 rd20は、乾燥や塩ストレスには誘導されるが、低温ストレスには誘導されない。 DREB1A/CBF3は、 AP2/ERF領域の低温誘導性転写因子。 どちらも乾燥条件で機能している。と考えられる。

今後の展望(DREB1Aについて) DREB1Aの標的遺伝子を、マイクロアレイにより同定することができた。 Result & Discussion 今後の展望(DREB1Aについて) DREB1Aの標的遺伝子を、マイクロアレイにより同定することができた。 DREB1A遺伝子の間接的な標的と、直接的な標的を区別することはできなかった。 この問題点や複雑な相互関係を明らかにするには、他のアプローチが必要となる。 他のアプローチ；それぞれのストレス誘導性遺伝子のプロモーター領域を使った、 　　　　ゲルシフト分析やcis-acting elementの解析のようなアプローチ

その他のストレス誘導性遺伝子 Result & Discussion →これら遺伝子はDREB1Aの標的遺伝子ではない (Figure 4) 乾燥ストレスと低温ストレス、双方に誘導される遺伝子の大半はDREB1Aであった。 しかし、4つの遺伝子はトランスジェニック植物の実験では、発現量が増えていなかった。 →これら遺伝子はDREB1Aの標的遺伝子ではない →ストレス応答性の遺伝子発現に関連する　　　　　　　　　新しい配列の存在 CCGAC core配列がFL5-3M24(4つのうちの1つ)の5´末端の2000塩基上流領域でも見られなかった。

今後の展望(マイクロアレイ) 遺伝子の発現量の体系的な方法 新しい遺伝子を見つけるために有効 Result & Discussion 今後の展望(マイクロアレイ) 遺伝子の発現量の体系的な方法 新しい遺伝子を見つけるために有効 植物ホルモン誘導性遺伝子、組織特有の遺伝子、標的遺伝子の同定に適用させていく。 遺伝子の発現量の体系的な方法というだけでなく、いくつかの条件や組織での発現量を見ることによって、新しい遺伝子を見つけるためのとても有効な手段と言える。 新しいストレス誘導性遺伝子や、その発現を制御する転写因子の標的遺伝子の同定するために、cDNAマイクロアレイを準備した。さらに、このcDNAマイクロアレイを植物ホルモン誘導性遺伝子、組織特有の遺伝子、標的遺伝子の同定に適用させていく予定である。