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二次元電気泳動の基本 補足：分子量の求め方 前回、前々回と二次元電気泳動の基本について勉強しました。
今回はその補足として、SDS-PAGEの泳動像からどうやって目的とするタンパク質の分子量を算出するのか、具体的な手順について説明したいと思います。 補足：分子量の求め方
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SDS－PAGEの泳動像から分子量を推定するには？
タンパク質のバンドの移動距離を、分子量が既知のタンパク質の ものと比較することで、目的のタンパク質の分子量を算出できる 同じゲルの中で既知のタンパク質（分子量マーカー）を泳動する 分子量マーカーのバンドの移動距離を測り、分子量と対応する 移動距離を片対グラフにプロットする 前回の勉強会で説明したように、SDS-PAGEはサンプルに含まれるタンパク質を各々の分子量に従って、分離することを目的とした電気泳動法です。 分子量が小さいタンパクはより速く、分子量が大きいタンパクはより遅く移動するので、移動距離の違いが生じ、タンパク質がそれぞれの分子量に応じてバンドとして検出されます。 その泳動像から、求めるタンパク質の分子量を推定するためには、同じゲルの中に分子量マーカーを泳動しておく必要があります。 分子量マーカーはあらかじめ分子量がわかっているタンパク質の混合物なので、そのタンパク質の分子量と移動距離を片対グラフ、つまりY軸が対数目盛になっているグラフにプロットすることで検量線をひくことができます。 その検量線と目的のバンドの移動距離から、求めるタンパク質の分子量を計算することができるわけです。 これを検量線として目的のバンドの移動距離から分子量を求める
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SDS-PAGEの分子量マーカーに使用される代表的なタンパク質
先ほど説明したように、既知の分子量を持つタンパク質を数種類混ぜ合わせたものが分子量マーカーです。 ここにあるのは一例ですが、同じ由来の同じタンパク質でもメーカーによって分子量が違う場合があるので注意が必要です。 市販の分子量マーカーは低分子用、高分子用、広範囲用に混合されているので、その中から自分の目的のタンパク質にふさわしい分子量マーカーを選ぶことが大事です。 例えば、低分子用の場合は97000Da、45000Da、29000Da、20100Da、14400Daの組合せで10%や15％の均一ゲルに流すとか、高分子用の場合は200000Da、116000Da、97000Da、66000Da、45000Daの組合せで7.5％の均一ゲルに、広範囲用の場合は200000Da、97000Da、45000Da,29000Da,20100Da,6500Daの組合せで8～20％のグラジｪントゲルに･･･といった具合に、使用するゲルの濃度に合ったマーカーを選択することが必要です。
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分子量算出の手順～バンドが綺麗に揃ったゲルの場合～
１）分子量マーカーの各バンドの位置を明確にし、分離ゲルの上端からの 移動距離を正確にはかる 分子量マーカー サンプル 3.6 6.7 12 .7 23.6 33.5 44.6mm それでは実際の分子量算出の手順について説明します。 電気泳動の条件は毎回微妙に変わってしまうので、検量線は必ずゲル1枚ごとにひかなければなりません。 つまり、電気泳動の際には必ず分子量マーカーを流す必要があるということです。 まず、バンドが綺麗に揃ったゲルの場合です。 わかりやすくするため、ここでは分子量マーカーの隣りのウェルにサンプルを流したところ、バンドが出現した･･･と仮定した図を描いてみました。 最初に分子量マーカーのバンドの位置を明確にし、分離ゲルの上端からの移動距離を正確に測ります。 実際のSDS-PAGEでは分離ゲルの上には濃縮ゲルがありますが、 （前回勉強したように）濃縮ゲルはアクリルアミドの濃度が薄くゲルの網の目が大きいので分子ふるいの効果はありません。 タンパク質はまず濃縮ゲルを通ることで濃縮され、全てのバンドが一ヶ所に重ねられてスタート位置につきます。 そして分離ゲルに入ったところで、移動速度の違いによりバンドが見分けられるようになるのです。 このことから、タンパク質の移動度は分離ゲルの上端からバンドの位置までの距離に反映されるので、この距離を称してバンドの移動距離と言います。
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２）片対グラフの横軸（普通目盛）に移動距離、縦軸（対数目盛）に分子量 をとり、分子量マーカーの各バンドの値をプロットする
２）片対グラフの横軸（普通目盛）に移動距離、縦軸（対数目盛）に分子量 をとり、分子量マーカーの各バンドの値をプロットする ３）移動度－分子量標準曲線を求める さきほどはかった移動距離と分子量の相関を表にするとこうなります。 次に片対グラフの横軸（普通目盛）に移動距離を、縦軸（対数目盛）に分子量をとり、分子量マーカーに含まれているタンパク質のバンドの値をそれぞれプロットします。 以前はグラフに手描きで点をプロットし、それをなめらかにつなぐことで検量線を導いていましたが、今はEcxelのグラフウィザードで簡単にグラフと標準曲線を求めることができます。 下のグラフはエクセルのグラフ機能を使って、近似曲線を求め、数式を導き出したものです。
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４）目的のバンドの位置を明確にし、移動距離を正確にはかる ５）その数値を３）で求めた標準曲線の式（y＝267249ｘ－0.7341）に代入し
分子量を算出する 分子量マーカー サンプル 28.5mm そして最後に目的のバンドの移動距離をはかり、そこで得られた数値を先ほどの数式に代入すると、求めるタンパクの分子量が計算できることになります。 267249×28.5 －0.7341＝ 求めるタンパクの分子量
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分子量算出の手順～スマイリングしたゲルや別のゲルで比較する場合～
１）分子量マーカーの各バンドの位置を明確にし、分離ゲルの上端からの 移動距離を正確にはかる ２）レーンの同じ場所で泳動のフロントラインの移動距離を正確にはかる 分子量マーカー サンプル 次にスマイリングしたゲルや、既知のタンパク分子を別のゲルで確認したい場合に、分子量を算出する方法について説明したいと思います。 スマイリングとは、ゲルの両端より中心部に近い方が泳動の進みが速くなり、バンドが笑った口のようにゆがんで出現する現象のことで、泳動中にゲルの温度が上がりすぎたり、サンプルの塩濃度が隣同士で大きく違っていた場合に起こります。 そのように、レーンで進み方に差があるバンドを比較するにはどうすればよいのか･･･ まず、先ほどと同じように各バンドの移動距離を正確にはかります。 次にフロントライン、これは主にBPB（ブロムフェノルブルー）と低分子タンパクが濃縮された部分ですが、この青いラインの移動距離を正確にはかります。 このとき大事なのはレーンの「同じ場所」で距離を測定するということです。 「同じ場所」とはレーンの右端ではかるなら全て右端ではかり、あるいは左端ではかるなら全て左端ではかる、という意味です。 BPB
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３）フロントラインの移動距離を１として、それぞれの分子量マーカーのバン ドの移動距離の相対値（＝相対移動度：Rf値）を計算する
サンプル 0.25 0.67 1.0 次にそのフロントラインの移動距離を１とした場合の、それぞれの分子量マーカーのバンドの移動距離を相対値で計算します。 この相対値を相対移動度（Rf値）といいます。
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４）片対グラフの横軸（普通目盛）にＲｆ値、縦軸（対数目盛）に分子量を とり 、分子量マーカーの各バンドの値をプロットする
５）Rf値－分子量標準曲線を求める 分子量とRf値の相関を表にするとこうなります。 そして（先ほどは移動距離を直接プロットしましたが）今度は片対グラフの横軸（普通目盛）にRf値、縦軸（対数目盛）に分子量をとり、分子量マーカーの各バンドの値をプロットしてExcelで標準曲線を求め、数式を導き出します。
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７）目的のバンドの位置を明確にし、移動距離を正確にはかる
８）そのサンプルが流れているレーンの同じ場所で、泳動のフロントライン の移動距離をはかる ９）フロントラインの移動距離を１として、目的のタンパク質のＲｆ値を計算し ５）で求めた標準曲線の式（y=15154x－ ）に代入すると、分子量が 算出できる 分子量マーカー サンプル 0.57 あとは先ほどと同じように目的のバンドの移動距離と、同じレーンの同じ場所でのフロントラインの移動距離を正確にはかり、そのフロントラインの移動距離を１として、目的のバンドのRf値を計算します。 それを標準曲線の式に代入すると、分子量を導き出すことができます。 1.0 15154×0.57 －0.7425＝ 求めるタンパクの分子量
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二次元電気泳動での分子量マーカーの使い方
のバンド ちなみに二次元電気泳動では、分子量マーカーは端のウェルに置くことが多いので、スマイリングがおきた場合、正確な相対移動度を求めることができません。 その場合は、一次元目の等電点ストリップをゲルの上端に置くときに、全体に分子量マーカーを流しておくと、図のように緯度線状にマーカーのバンドが検出されるので、スマイリングがおきていても正確な分子量を決めることができます。
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SDS-PAGEで分子量を測定する上での注意点
小さくなる＝見かけの分子量が大きくなる ・タンパク分子内に疎水性に富んだ部分が多い場合は、SDSの結合量も 多くなり、移動度が大きくなる＝見かけの分子量が小さくなる ・糖タンパク質や酸性タンパク質はSDSの結合量が少なく、移動度も小さい ＝見かけの分子量が大きくなる ・多量体やサブユニット構造をとっているタンパク質分子では、SDS-PAGEで わかるのはその単一ポリペプチドの分子量だけで、その分子が生体内で 機能している状態の分子量はわからない 例） 免疫グロブリン＝重鎖2本と軽鎖2本がS-S結合した構造をもつ 最後になりますが、SDS-PAGEで分子量を測定する場合の注意点について申し上げます。 SDS-PAGEでは前回勉強したように、タンパク質1gに対してSDSが約1.4gの割合で結合します。 それにより、タンパク質固有の電荷が打ち消され、均一な負の電荷がタンパク分子に与えられることになります。 また、還元剤でS-S結合や水素結合を切断することで、タンパク質の高次構造が開かれ、棒状の形をしたSDS-タンパク複合体になります。 電荷の違いと構造の違いによる移動度の差をなくすことで、分子量の違いにより、タンパク分子を分離することができるようになるのです。 この方法もタンパク質の性質によって、さまざまな誤差が生じる場合があります。 例えば･･･ そして多量体やサブユニット構造をとっているタンパク質分子、つまりいくつかのポリペプチド同士が結合してひとつの機能を担っているタンパク分子の場合、SDS-PAGEではバラバラにされた単一のポリペプチドがバンドやスポットとして出現するので（逆に）そのタンパク質が生体内で機能している状態の分子量はわからないことになります。 例えばおなじみの免疫グロブリンは、重鎖2本と軽鎖2本がS-S結合した構造をとっています。 これが還元剤の作用で切断されると【クリック】約50kDaと約22ｋDaの場所にバンド、あるいはスポットがそれぞれ出現します。 S-S結合の切断により約50kDaのバンドと約22kDaのバンドがそれぞれ現れる
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免疫グロブリンの構造 2本のL鎖と2本のH鎖で 構成されている L鎖とH鎖、H鎖とH鎖同士はS-S結合で結ばれている
黄色い部分＝Light chain （L鎖） 緑色の部分＝Heavy chain （H鎖） L鎖とH鎖、H鎖とH鎖同士はS-S結合で結ばれている 免疫グロブリンの構造です。 免疫グロブリンは2つのH鎖と2つのL鎖でできています。 図の黄色の部分が「軽い鎖」という意味でLight chain（通称L鎖） 緑色の部分が「重い鎖」という意味でHeavy chain（通称H鎖）と呼ばれています。 このうちH鎖はγ鎖、α鎖、μ鎖、δ鎖、ε鎖の5種類に分類されそれぞれIgG、IgA、IgM、IgD、IgEに対応しています。 一方、L鎖はすべての免疫グロブリンに共通であり、κ鎖とλ鎖に分けられます。 1分子の免疫グロブリンは、κまたはλ鎖いずれか一方を2本ずつもっていることになります。 L鎖とH鎖、そしてH鎖とH鎖同士はS-S結合で結ばれています。 このため、S-S結合を切断する還元剤を加えて処理したサンプルでは、それぞれ別の分子量をもつスポットとして出現するのです。
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