Poly(A)＋精製 準備 Oligotex TM-dT30<Super> ３７℃

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1 Poly(A)＋精製 準備 Oligotex TM-dT30<Super> ３７℃
TaKaRa Poly(A)＋Isolation Kit from Total RNA 準備 Oligotex TM-dT30<Super> 　３７℃ ２×Binding buffer 　　　　　　３７℃（溶解）　約１５分 ヒートブロック　　　　　　　　　７０℃ DEPC　H2O　　　　　　　　　　７０℃　多めに分注しておくと冷めない 方法 1. Total RNA 　　　　　　　　　100μｇ/200μｌ　最小２本の系でスタート ２×Binding buffer 　　　　　　200μｌ Oligotex TM-dT30　　　　　　　　　　　15μl Total μl 2.７０℃　５min 3.室温　１０min rpm 5min 4℃ 5.上清除去　　（実験終了まで保存） 6.沈殿にWash buffer 350μl 加え懸濁 7.スピンカラムのフィルターカップに入れる rpm　1min 9.フィルターカップを新しいエッペンに移す 10.Wash buffer 350μl加え懸濁 rpm　１min 12.フィルターカップを新しいエッペンに移す 13. DEPC H2O(70℃）加え懸濁 (1回目50μl,2回目30μl,3回目20μl） rpm　１min　 15.13,14を計3回繰り返す 16.２本分を１本にまとめる 17.３M AcONa 1/30、Ethachinmate 2μl 18.ボルテックス 19.イソプロパノ－ル　等量 ←実験を止めるならここ。

2 20.ボルテックス rpm　10min　4℃ 22.上清除去 23.70%EtOHリンス 24.DEPC H2O　に溶解　濃度2μg/10.5μl以上 2ulは濃度測定用 残りはｃDNA合成に　 したがって、13ulに溶解するとよい。 例 [イネカルス] スタート　Total RNA 100μg×２ 濃度　576.8nｇ/μl 収量　7.498μg →3.47μl/2μgを次のｃDNA合成に用いる エタチンメイトあり無しの比較 スタート　TotalRNA　100μg×２ [イネの根] スタート　Total RNA 100μg No16のステップで濃度測定した時 濃度　42.24ng/μl 収量　3.38μg

3 Takara cDNA synthesis kit (M-MLV version)
０．温子は65℃、冷子は42℃に設定する。 １．1st　Strand　ｃDNA合成反応 　　鋳型RNA（約2ug）　 Xul 　　 H2O 　　　8.5-Xul 2. 軽く攪拌 ３．65℃　5分間　On　Ice　（ □ Timer　Set） ４．Spin　down ５．PreMixを調整 　　⑤5×Buffer　　　 　 　　4ul　 　⑥dNTP Mixter 　　 1ul 　　α32-P ｄCTP 　　　　　0.5ul 　　②RNaseInhibitor 　 1ul 　③Oligo dT 　　2ul 　　　　　　　①M-MLV RTase 　 　3ul　 　　　　（Takara Reverse Transcriptase 　　　　　　　　　　　　　M-MLV RNase- code 2640A) 　　PreMixを４に加えて→ MIX→SpinDown ４．42℃　1hr　 （ □ Timer　Set） ５．On　Ice　for　2min　 （□Timer　Set） 　　冷子を16℃にする。 ＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊ 6．1ulを取り込み率計算に使う。 　　→ ulの20mM EDTAを加えてよく混ぜる。 　　　 ulずつ2枚のDE81フィルターにスポット。 　　　 一枚は0.5M Na2HPO4(pH7.0) 5min ×6回→ 　　　　　　　→DW　1min　×2回　→70％　EtOH　1min×2回 　　　　DE　Paperはもろいのでピンセットは極力使わないで廃液はスポイトで吸いだして捨てる。 　　　 　　Dry Up→　液シンで測定　 Pre Mixture　（11.5ul）

4 冷子を16℃にする。 ７． 2nd　Strand　ｃDNA合成反応 　　サンプル　　　　　　19ul 　　 ⑨5×Buffer　　　30ul 　　 ⑥dNTPs ul 　　α32-P ｄCTP 　　 5ul 　DEPC 　 85ul 8. 　⑧E.coli DNA Polymerase ul 　⑦E.coli RNaseH / 　　　　E.coli DNA Ligase Mixture 2ul PreMixを６．に加えて軽く攪拌 9. 16℃　2hr　 （ □ Timer　Set） 10. 70℃　10min　 （ □ Timer　Set） 11. ⑩T4　DNA　Polymerase 4ul　を加えて軽く攪拌 12. 37℃　10min （ □ Timer　Set） M EDTA(pH8.0) 15ulと10% SDS溶液15ulを加えて 攪拌し応を停止する。 ＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊ 6．1ulを取り込み率計算に使う。 　　→ ulの20mM EDTAを加えてよく混ぜる。 　　　 ulずつ2枚のDE81フィルターにスポット。 　　　 一枚は0.5M Na2HPO4(pH7.0) 5min ×6回→ 　　　　　　　→DW　1min　×2回　→70％　EtOH　1min×2回 　　　　DE　Paperはもろいのでピンセットは極力使わないで廃液はスポイトで吸いだして捨てる。 　　　 　　Dry Up→　液シンで測定　 Pre Mixture　(127ul)

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6 Sizesep 400 Spun Columnを用いた精製
Loading　volume ５０～１１０μl　なので2本用意する インバージョン（5回）してよく混ぜる　静かに キャップを外す。 15mlのファルコンにセットしてチューブラックに立てる 15分放置して　バッファーを流す。 ２ｍｌのバッファー（使用に応じて選択）を加えてインバージョン（今回はTES）　静かに ４．へ ４．5．を二回行う。 　　　　15分以内にバッファーが流れ切ることがあるのでカラムが乾かないようにストップする ８．　下のキャップ　上のキャップの順で閉めて、使用まで置いておく。 ９．　直前にSpin　Down（1800rpm　2min）して余分のバッファー 　　　を捨てる。 １０．カラムの重量を測定し、Spin Downして1番軽いカラムに合わせる 　　　　残っているバッファーの量をそろえることでエタチンのロスをそろえることができる １１．　15mlのファルコンチューブに蓋を切り取った1.5mlのチューブをSetする。 １２．　カラムを15mlのキムワイプ入りの15mlファルコンに移す。 １３．　サンプルを89.5μlづつ2本のカラムの中心にアプライする。 １４． 　Spin　Down（1800rpm　２min）する。 １５．　サンプルを1本にまとめる １６．　３M AcONa 1/30,Ethachinmate 2μl,Isopropanol等量 １７．　ボルテックス １８． 15000rpm、10min,4℃ １９．上清除去 ２２．70％EtOHリンス ２３．１ｋｃｐｍ/μlになるようにMQに溶解（ただし＜40μl）

7 順次ラベリングを行った場合の取り込み効率の計算
1ｓｔ strand 合成反応の際のTotal　cpm、Sample　cpmをそれぞれ ①、②とする。2nd strand 合成反応の際のTotal　cpm、Sample　 cpmをそれぞれ③、④とする。 １ｓｔ　Strand ｃDNA　合成反応 　　　取り込み効率＝（②/①）×100％ ２nd　Strand ｃDNA　合成反応 　　　取り込み率＝ （④－②/9） ×100％ （③－①/9） 反応収率の計算 A　ｃDNA合成量の計算 １ｓｔ　Strand ｃDNA　合成量(ng）　＝取り込み率（％）×132 2nd　Strand ｃDNA　合成量（ng） ＝取り込み率（％）×528 B　合成収率の計算 　 １ｓｔ　Strand ｃDNA合成収率＝ １ｓｔ　Strand ｃDNA合成量 ×100％ 鋳型RNA量 2nd　Strand ｃDNA合成収率＝ 2nd　Strand ｃDNA合成量 ×100％ １ｓｔ　Strand ｃDNA合成量

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9 制限酵素処理 アダプターライゲイション ds-cDNA xμl/100ng １０×M Buffer 4μl H2O 35.5-x μl
AvaⅡ　　　　　　　　　　0.5μl　　　　　 Total　　　　　　　　　　　４０μl １．３７℃、＞１ｈｒ ２．TaqⅠ　　１μl ３．６５℃、＞１ｈｒ アダプターライゲイション ＡｖａⅡ　adapter top 5’CTCGTAGACTGCGCGTACC 3’ btm 5’GWCGGTACGCAGTCTAC 3’ TaqⅠ　adapter top 5’GACGATGAGTCCTGAG 3’ btm 5’CGCTCAGGACTCATC 3’ dｓ－ｃDNA(digested) μl 5×ligation additional buffer 　 2μl 25mM AvaⅡ adapter　　　　　　3.5μl 25mM TaqⅠ adapter　　　　 　 3.5μl T4DNA ligase　　　　　　　　　　　　1μl　　取り扱い注意 Total　　　　　　　　　　　　　　　　　50μl １．１６℃、＞３ｈｒ ２．Ligate 希釈液　４５０μl（１０倍希釈）

10 マーカー作製 ①ＡｖａⅡ＋ＴａｑⅠ ②ＡｖａⅡ ③ＴａｑⅠ ① ② ③ ｐTEST 2.35μg 2.35μg 2.35μg
　　　　　　　　　　　　①　　　　　　②　　　　　　③ ｐTEST　　　　　　2.35μg　　2.35μg　　2.35μg 10×M buffer 　　2.5μl　　　 2.5μl 　　　 2.5μl 　 AvaⅡ　　　　　　　0.5μl　　　　0.5μl TaqⅠ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.5μl Total μl　　　　 25μl　　　　 25μl 　　　　　　　　　　　　　37℃、＞２ｈｒ 　　　　　　　　　　　　Add TaqⅠ　1μl 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　65℃、＞２ｈｒ 6％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で確認する 　２００Ｖ　４０Ａ（ゲル1枚）　30分 制限酵素処理はオーバーナイトで行わない

11 PCR ＴａｑⅠprimer (Taq１－ｐ） 5‘ AGACTGCGTACCGWCC 3’ ＡｖａⅡprimer（Ａｖａ２－ｐ）
オレンジ色のテープが貼ってある ＴａｑⅠprimer (Taq１－ｐ） 　　5‘ AGACTGCGTACCGWCC 3’ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＥＮＺ ＡｖａⅡprimer（Ａｖａ２－ｐ） 　　5’ GATGAGTCCTGAGCGA 3’ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＥＮＺ #1 AvaⅡ＋TaqⅠprimer #2 TaqⅠpreimer #3 AvaⅡpreimer #4 non primer #5 non template # #2 #3 #4 #5 1/10 ligate 10×Gold buffer 25mM MgCl 2.5mM dNTP 2.5mμM　TaqⅠprimer 2.5mμM　AvaⅡprimer H2O　　　　　　　　　　　　　　 1/10 Amp taq gold (μl） Total (μl） PCR 94℃　　10min 94℃　　0.5min 50℃　　１min cycle 72℃　　1min 4℃　　　∞

12 ds-cDNA electrophoresis
0.8% agarose gel 1×TAE　Buffer ６XDye アプライするSampleはTotal1000cpmくらいが良い。 １．100V 　で約30-40分 ２．泳動後　マーカー部分は切り取ってEtBr染色 ３．残りは10％TCA溶液中で30分固定（腐食性危険）。 　　シェーカーで穏やかに振とう・固定。廃液は廃液入れに 　　この間に切り取ったゲルをEtBr染色して写真をとる。 ４．水ですすぐ　廃液はPの廃液入れに ５．Dry upする。 ろ紙を3枚　キムタオルを数枚（一枚を切る） 　　ガラス板の上にサランラップを敷く、キムタオルを2枚、 　　ろ紙を3枚、ゲル、　ろ紙3枚、キムタオル2枚、サランラップ 　　ガラス板　（急ぐときはせっせとタオルを換える。） ６．２0－30分で水分が抜かれてペッタンコになる。 ７．サランラップに包んでオートラする。 ８．12時間　BioMax。O/NならRXUのフィルムで十分。 FreeのｄCTPは 300bp付近に出る ここに出たらOut Dyeは3/4 くらいまで流す。 Bufferの温度 に注意。 Size　Marker λHindIIIと ｐGEM/RsaI 切り取るので必ず１レーン空ける

13 順次ラベリングを行った場合の取り込み効率の計算
1ｓｔ strand 合成反応の際のTotal　cpm、Sample　cpmをそれぞれ ①、②とする。2nd strand 合成反応の際のTotal　cpm、Sample　 cpmをそれぞれ③、④とする。 １ｓｔ　Strand ｃDNA　合成反応 　　　取り込み効率＝（②/①）×100％ ２nd　Strand ｃDNA　合成反応 　　　取り込み率＝ （④－②/9） ×100％ （③－①/9） 反応収率の計算 A　ｃDNA合成量の計算 １ｓｔ　Strand ｃDNA　合成量(ng）　＝取り込み率（％）×132 2nd　Strand ｃDNA　合成量（ng） ＝取り込み率（％）×528 B　合成収率の計算 　 １ｓｔ　Strand ｃDNA合成収率＝ １ｓｔ　Strand ｃDNA合成量 ×100％ 鋳型RNA量 2nd　Strand ｃDNA合成収率＝ 2nd　Strand ｃDNA合成量 ×100％ １ｓｔ　Strand ｃDNA合成量

14 I II a b AvaII TaqI adapterの作成 100uM AvaII or TaqI btm 50ul
10mM ATP ul 10×Kinase　Buffer（Toyobo)　　　　10ul T4　Kinase　（Toyobo)　　　　　　 ul dH2O ul 100ul I 37℃　2時間以上 b 100uM　AvaII or TaqI　Top 　　　　　 ul 20mM Tirs Acetate , 30mM Mg Acetate ul 100ul II IとIIを全て混合して Boil　for　3min 徐冷して ２５ｍM　AvaII　adapter ２５ｍM　TaqI　　adapter　　　出来上がり。

15 5×Ligation additional buffer 組成
50mM Tris Acetater (pH7.5) 50mM Mg Acetate 250mM K acetate 25mM DTT　（AmashamのTime　Saverに添付されていたもの） 250ug BSA 　(TaKaRa のNcoIのKitに添付されていたもの） 5mM dATP　（AmashamのTime　Saverに添付されていたもの） 作り方 　 　 １M　 Tris Acetater (pH7.5)　 50ul 　　 １M　　Mg-Acetate　　　　　 　 50ul 　　 ５M　　AcOK　　　　　　　　　 ul 75ｍM DTT　　　　　　　　　　 ul 　 %　 BSA　　　　　　　　　　　　 250ul 75mM dATP ul ｄH2O　　　　　　　　　　　 　　up to 1ml　　　　　　　 Ligate希釈液組成 １０ｍM　Tris-HCi　（ｐH7.5) 　0.1mM 　EDTA　　　（ｐH8.0)

16 1×Ligation　buffer 　　Takara 　　　66mM Tris-HCl (pH7.6) 6.6mM MgCl２ 　 10mM DTT 　　　　1mM 　ATP 　　NipponGene 　　　50mM Tris-HCl (pH7.9) 　10mM MgCl２ 　 20mM DTT 　　　　1mM ATP 　　NEB 　　　66mM Tris-HCl 　　10mM MgCl２ 　　 1mM DTT 　　　7.5%　PEG6000　　 New　Ligation　additional buffer 組成 　　　850mM 　Tris-HCl (pH7.9) 　480mM 　MgCl２ 　 　50mM 　DTT 　　　　25mM 　ATP 1X NipponGene　A buffer( TaqI)　＆　NEB buffer 4 (AvaII) 50mM K acetate 20mM Tris acetate 10mM Mg acetate 1mM DTT　 1XRL buffer 50mM K acetate 10mM Tris Acetater (pH7.5) 10mM Mg Acetate 5mM DTT　 50ug BSA 1mM dATP

17 シーケンスゲル作成 6％ 変性ゲル MQ up to 100ml / 2枚分 40％ アクリルアミド溶液 アクリルアミド 38g
40％　アクリルアミド溶液 　　　　　アクリルアミド　　　　　　　38g 　　　　　N-N´-エチレンビス　　　　　2ｇ MQ　up to 100ml ろ過して4℃　保存 6％　変性ゲル 40％　アクリルアミド　　　　　15ml 10×　TBE　　　　　　　　　　　10ml Urea　　　　　　　　　　　　　　　４２ｇ MQ　up to 100ml　/　2枚分 ゲル板をコンタミノン液体でよく洗う。 ↓ 70%EtOHをかけて　乾かす。 70％EtOHでよく磨く。 ノッチ付のゲル板だけSigmasoatでシリコナイ処理する＠ドラフト ゲル板に10-15ulずつSigmacoatを上中下と垂らしてよくのばす。 2時間以上乾燥させる。 尿素が溶けずらいので　60-70℃で湯煎しながら溶かす。 0.22のミリポアフィルターでろ過、綺麗なビーカーに移す。 20分減圧　＠デジケーター 10％　APS　500ul TEMED　50ul 加えて30秒良く混ぜる ゲル板へ流し込む。2時間以上置き乾燥させる。

18 シーケンスゲル電気泳動 ゲルの固定と乾燥 １．1500V ２７ｍAで30分以上Pre-Runする。
２．尿素が析出するのでシリンジで洗い流す。 ３．シャークコームをセットする。 ４．サンプルをアプライする。 ５．2200V　27mAで　2.5hr　Runする。 ゲルの固定と乾燥 ノッチの方を上にしてゲル板をおく。 ↓ ゲル板の隙間からミクロスパーテルを入れてゲル板をはがす。ゲル板は速やかに洗う。 （酢酸メタノールで固定はしない） ろ紙を　50cm　×　20cmに切っておく。 ろ紙の裏にはSampleの名前や日付を入れる。 真ん中をたわませて、一気にのせて、手でなじませる。 ゲルをろ紙ごととる。 サランラップを被せる。 いらない所を切り取る。 ゲル乾に1-2hrかける。

19 シーケンスゲル作製図 キムタオルで 高さ約2ｃｍの枕を入れる 5mm 前日に作成した場合、ゲルが乾燥しないようにコームを抜いて
濡れたキムワイプで上部を包みサランラップで包んでおく

20 Pre－PCR 1/10 Ligate 2 10×Buffer 2 2.5ｍM dNTPs 1.6 2.5mM MgCl2 2
2.4umol AVAII-G Primer 2.4umol TaqI-G Primer Gene taq H2O 20ul 95℃　　　　　　1min 94℃　　　　　　30s 56℃　　　　　　60s 72℃　　　　　　60s 　4℃　　　　　　∞ 20cycles PCR　products　　　５ul TE　　　　　　　　　　245ul 250ul Primer　& Labeling 10 ×　Kination buffer　　　　　　　　　　2ul 20uM　AvaII-GN　　　　　　　　　　　　0.8ul [γ32P]ATP　　　　　　　　　　　　　　　　2ul 1/10　T4　Poly　nucleotide　Kinase　　2ul ｄH2O　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2ul 10ul

21 Selective－PCR 37℃ 1hr incubation 70℃ 10min inactivation
1/50 　PCR products 10×Buffer 2.5ｍM dNTPs 2.5mM MgCl 2.4umol AVAII-G Primer [32P]　 1 2.4umol TaqI-G Primer[32P]　 Gene taq H2O 20ul 95℃　1min 94℃　30s 65℃　60ｓ 72℃　60s －0.7　℃/cycle　(touch　down） 94℃　30s 56℃　60ｓ 72℃　60s 4℃　　∞ 20cycleｓ

22 Add equal volume STOP solution
↓ 4℃　 94℃　1min 2℃　∞ Electrophoresis XC　　　1mg/ml BPB　　1mg/ml 98％　　formamide 10mM 　EDTA

23 ゲルからのDNA抽出と再増幅 2×PCR 緩衝液100ulを加える。 ↓ 室温で10分静置 粉砕 94℃ 90分
94℃　90分 2×PCR緩衝液で10倍希釈 2.5ulをテンプレートとしてPCRを行う。