Alcian　Blue　 & PAS.

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1 Alcian　Blue　 & PAS

2 Alcian Blue 目的 試薬 □アルシアンブルー液 Alcian blue 8GX 1g □3%酢酸水 □ケルンエヒトロート
アルシアンブルーは、粘液を染める組織染色法としてSteedman (1950年)が導入した色素。 シアル化されたムコ物質（シアロムチン）、硫酸基を有するムコ物質（スルホムチン）、軟骨や線維性結合組織に含まれるコンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸のような酸性ムコ多糖類を特異的に染色するために用いられる。 色素が結合した部位は青藍色に鮮やかに染色される。 試薬 粘液（厳密にはムコ物質、ムチン）を染める組織染色法としてSteedman (1950年)が導入した色素である。 現在ではシアル化されたムコ物質（シアロムチン）、硫酸基を有するムコ物質（スルホムチン）、軟骨や線維性結合織に含まれるコンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸のような酸性ムコ多糖類を特異的に染色するために用いられる。色素が結合した部位は青藍色に鮮やかに染色される。 □アルシアンブルー液 　　Alcian blue 8GX　　　1g 　　酢酸　　　　　　　　　　3ml 　　蒸留水　　　　　　　　97ml □3%酢酸水 □ケルンエヒトロート

3 原理 カルボキシル基 例） アラニン CH3CH(COOH)NH2 硫酸基 例） 粘膜など 軟骨やヒアルロン酸など。 O - O = S
塩基性色素であるアルシアン青と、酸性ムコ物質のカルボキシル基あるいは硫酸基のイオン結合に結びついている。 特異性はアルシアン青の溶液中の水素イオン濃度や電解質濃度によって変化する。 pH2.5の溶液ではカルボキシル基と硫酸基の両者に、pH1.0の溶液では硫酸基のみに結合する。 カルボキシル基 　例）　アラニン　CH3CH(COOH)NH2 　　　　　　　筋肉中に含まれるアミノ酸。 硫酸基 　例）　粘膜など 　　　　軟骨やヒアルロン酸など。 O - O = S = O O - 正確に3% 酢酸水を作ると pHはほぼ2.5 となる。 = O R - C - OH - R

4 Al 染色法 脱パラ・流水水洗 ３％酢酸水 アルシアン青溶液 流水水洗 ケルンエヒトロート 流水水洗 脱水・透徹・封入 3分 20分 5分
酢酸で前処理後に染色。 3分 20分 5分

5 Al 染色結果 結腸の粘膜 杯細胞と気管支軟骨内 左：結腸の粘膜（杯細胞）から産生されている酸性粘液
                                                                                                                          Al　染色結果 左：結腸の粘膜（杯細胞）から産生されている酸性粘液 右：粘膜内の杯細胞の酸性粘液と気管支軟骨内の酸性粘液多糖類 結腸の粘膜 杯細胞と気管支軟骨内

6 PAS 目的 PAS反応は、多糖類の組織化学的証明法として発展し、現在では肝臓のグリコゲン、消化管の粘液物質の証明、色素顆粒や細胞顆粒、真菌、アメーバの識別および腎糸球体病変の識別等、広く糖質の一般染色として知られている。 試薬 糖質を過ヨウ素酸で酸化し、生じたアルデヒド基（-CHO）がシッフ試薬と結合して赤色を呈する。 ■0.5%過ヨウ素酸水溶液 ■シッフ試薬　　 ■ヘマトキシリン ■亜硫酸水　 　　　　10%重亜硫酸ナトリウム　6ml 　　　　1N塩酸　5ml　 　　　　精製水　100ml

7 PAS 染色法 脱パラ・水洗 過ヨウ素酸水溶液 精製水水洗 シッフ試薬 亜硫酸水×３回 流水水洗 ヘマトキシリン 流水水洗 脱水・透徹・封入
20分 20秒 各3分 5分 過ヨウ素酸は毎回新調し、常温で１５分をこえないようにすること。 シッフ試薬は、汚染を防ぐために標本の水分をよく除去すること。 亜硫酸水は毎回新調し、シッフ試薬から水洗せずに直接亜硫酸水へ移すこと。 核染色はPAS反応により核酸が酸化されて塩基性色素に親和性が増しているので、染色時間は普通のときより短くていい。

8 グリコゲン、中性粘液多糖類、糖蛋白、粘液蛋白、糖脂質
PAS　染色結果 糸球体 核 グリコゲン、中性粘液多糖類、糖蛋白、粘液蛋白、糖脂質 　　　　　 赤紫色 陽性細胞 細胞内グリコゲンや中性粘液,卵巣の濾胞液,軟骨基質,甲状腺コロイド,副腎のクロム親和性物質,下垂体の腺細胞の顆粒,リポフスチン,腎糸球体や尿細管基底膜や硝子滴,小血管のフィブリノイド変性や硝子化,前立腺内容,脾やリンパ節の細網線維や小血管,好中球,肥満細胞,骨髄巨細胞,赤痢アメーバ,真菌類,細菌類

9 重染色 グリコーゲン 中性粘液 酸性粘液 多糖類
pH2.5アルシアンブルーとPASの重染色法を使用すると、中性ムコ多糖類はシッフ試薬で赤く染まり、酸性ムコ多糖類はアルシアンブルーで青く染まる。 特異性の異なる２種類の染色法を単一切片上で行い、より多くの情報を同時に得ようとするもの。 最初に行なわれる染色法はそのまま特異性が再現されるが、後続の染色は特異性がすでに制約されていることを考慮しなくてはならない。 そのため、さらに個々の単染色を同時に行なうことが必要である。 PAS ：グリコーゲン、中性粘液 両方：酸性粘液 AL　：酸性粘液、多糖類 グリコーゲン　　 中性粘液　 酸性粘液 　　酸性粘液 　多糖類 両方 PAS AL

10 脾臓 腎臓 心臓 肝臓 脾臓の繊維性結合組織：PAS 腎臓の糸球体基底膜：PAS 心臓の筋肉（アラニン）：AL