RNA i （RNA interference）.

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1 RNA i （RNA interference）

2 RNAiとは？ RNAi(RNA interference)とは、ある遺伝子と相同な、センスRNAとアンチセンスRNAからなる二本鎖RNA(double-strand RNA；dsRNA)が、その遺伝子の転写産物(mRNA)の相同部分を破壊する、という現象で、1998年に線虫を使用した実験によりはじめて提唱されました。 (Fire A,et al:Nature(1998)391: ) RNAiは発見された当初、哺乳動物細胞においては、約30bp以上のdsRNAを細胞内へ導入すると、細胞が本来持っている免疫機能によりアポトーシスを起こし、細胞が死んでしまう為、哺乳動物細胞での利用は困難と思われていました。 しかし、2000年に、マウス初期胚や哺乳動物培養細胞でもRNAiが起こり得ることが示され、RNAiの誘導機構そのものは、哺乳動物細胞にも存在することがわかってきました。 (Ui-Tei K,et al：FEBS Lett(2000) 479：79-82) 2001年、さらに短い(21～23bp)のdsRNA(small interfering RNA；siRNA)が、哺乳動物細胞系でも細胞毒性を示さずにRNAiを誘導できることが示されました。(Elbashir SM,et al：Nature(2001)411: )

3 現在は27bpのsiRNAの方がより効果的であるとの発表もされています。
従来の遺伝子機能解析は、ある表現型に関わる遺伝子をクローニングし、塩基配列を調べる、といった手順で進められていました。しかし、ヒトを含めたいくつかの生物でその全塩基配列が決定されている現在(ポストゲノム時代)、決定された遺伝子の塩基配列からその機能を解析するようになってきました。 RNAiは配列が知られている標的遺伝子のmRNAをノックアウト(破壊)することによりその遺伝子の機能を探索することができる画期的な方法です。 RNAi法のその他の利点として、低濃度でも効果が期待でき、mRNAを破壊するだけである為、ゲノム遺伝子には影響を及ぼさない、ことが挙げられます。

4 どういうことが起こっているのか？ RNAi（RNA interference,RNA干渉）とは、
２本鎖RNA（double-stranded RNA;dsRNA）が引き金となって そのアンチセンス鎖<siRNA（small interfering RNA) >と相補的な 配列のmRNAが分解され、それにより遺伝子の発現（形質発現）が 抑制される現象のことです。 ２本鎖RNA Ｄｉｃｅｒ（ＲＮＡ分解酵素） siRNA

5 遺伝情報のリボゾーム上での翻訳（ｍＲＮＡとｔＲＮＡアミノ酸との結合） タンパク質合成 形質発現 siRNAによってｍＲＮＡが分解される
ｍＲＮＡを切断する siRNA ｍＲＮＡ ＲＩＳＣ （RNA Induced Silencing Complex） ＤＮＡの遺伝情報 ｍＲＮＡへの 遺伝情報の転写 遺伝情報のリボゾーム上での翻訳（ｍＲＮＡとｔＲＮＡアミノ酸との結合） タンパク質合成 形質発現 siRNAによってｍＲＮＡが分解される

6 タンパク質の合成過程 G A tRNA C mRNA C G A 結合 A G C A G U C G U C C G U C C G C
アミノ酸 タンパク質の合成過程 Ala アミノ酸の運搬 Ala Ala mRNA Ser C G A 合成されたタンパク質 Gly 遺伝情報の翻訳とタンパク質の合成 Leu （ポリペプチド鎖） Ala Gly 結合 Ser A Ala Val G C G A C リボゾーム A G U C G U C C G リボゾームの進行方向 U C C G C A G U C U A G G U U C 塩基３つ分ずつ移動する

7 設計する際の注意点 1.スタートコドンから、75塩基以上下流の最初のAAを見つけます。 (転写因子の結合部位を避ける狙いがあります。)
2.デザインした塩基配列が他の遺伝子（off-target）のノックダウンを引き起こさないように、特異性の高い配列を検索する。 3.デザインした塩基配列の中にSNPsの報告がないことの確認。 ● (SNP スニップ) シングル・ヌクレオチド（塩基）ポリモルフィズム（多型）の略称で、「一塩基多型」とも呼ばれます。　２人以上のヒトのゲノムを比較すると３０００Ｍ（メガ）bpのうち、９９．９％は塩基配列が同じです。残り０．１％（約３００万bp）は個人の間で差があると言われています。約１ｋ（キロ）bpに１つ違いがあるということです。

8 例えば、Ａという人からのある遺伝子ＤＮＡの一部分を取り出します(TCGATCGA) 。これとＢという人の同じ遺伝子からのＤＮＡを取り出し(TCGATTGA)、比較します。両者を比較すると、同じ遺伝子のＤＮＡでありながら、Ａのシトシン（Ｃ）の１つが、Ｂではチミン（Ｔ）に変わっています（ミスマッチ）。これが、Single Nucleotide Polymorphism (SNP):一塩基の多型性です。ＳＮＰのタイプにより、遺伝子を元に体内で作られる酵素などのタンパク質の働きが微妙に変わります。 肌の色や体質の違いもＳＮＰが原因と考えられています。 ＳＮＰは親から子へバラバラに伝わるのではなく、いくつかまとまったパターン（ハプロタイプ）で受け継がれると考えられている。このパターンが、病気のかかり易さ・副作用の発生率などの体質の元になるとされています。このＳＮＰのまとまりが人間の２３対の染色体のどこにあるかは不明です。