免疫・血清検査 感染症編.

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1 免疫・血清検査 感染症編

2 Q A 病原体を分離・培養しなければ、感染症を 診断することはできないのでしょうか？
そんなことはありません。病原体そのものを培養できなくても、感染を証明することができます。 病原体の構成成分や産生蛋白に対する 抗体を検出 病原体で産生される 蛋白を検出 病原体の構成 成分を検出 核酸(DNA・RNA)を 検出(遺伝子検査) 細菌・真菌 ウィルスなど

3 HBs抗原 HBV-DNA Core 抗原 (HBc抗原 + HBe抗原） Ｂ型急性肝炎(一過性感染)の経過で説明してみましょう。
HBsAg IgG-HBcAb HBs抗原 感染 HBeAb HBsAb HBeAg HBV-DNA IgM-HBcAb 期間 1～6ヶ月 1～2ヶ月 2～3ヶ月 4ヶ月以後 Core 抗原 (HBc抗原 + HBe抗原） 潜伏期 急性 後期 HBV増殖 停止 HBV感染の 既往 回復期 急性初期 HBV増殖 IgM型のHBc抗体は、発症初期より陽性となり、2～12ヶ月で 陰性化しますが、IgG型のHBc抗体は長期間陽性を持続します。

4 HBVキャリアの場合、各ウィルスマーカーの推移は 急性肝炎と異なるので注意しましょう。
HBe抗原陽性 無症候性キャリア期 肝炎期 HBsAg HBeAg HBeAb IgG-HBcAb HBsAb HBe抗体陽性 HBVキャリアでは、急性肝炎で陽性となるIgM型のHBc抗体が 肝炎期を除いて、ほとんど検出されません。一方、IgG型の HBc抗体は、高値を示します。

5 HCV-RNAの構造とHCV抗体との関係
Q C型肝炎ウィルスについてもB型と同様の 抗原や抗体の検査があるのですか？ A C型肝炎ウィルスについては、RNAを包むコア蛋白(抗原)とコア蛋白や非構造領域など複数の抗原に対する抗体を 検出する検査が使われています。 エンベロープ蛋白 (膜蛋白） HCV-RNAの構造とHCV抗体との関係 5’ 3’ Core E1 E2/NS1 NS2 NS3 NS4 NS5 HCV-RNA 第1世代 第2世代 コア蛋白 第3世代

6 HCVに感染していない可能性が極めて高い
抗体陽性 抗体陰性 高力価 中力価 低力価 HCV抗原検査 抗原陽性 抗原陰性 HCV-RNA検査 RNA陽性 RNA陰性 HCVに感染している可能性が極めて高い HCVに感染していない可能性が極めて高い

7 C.O.I. ： 検体の発光量÷（標準血清の発光量×0.28）
HCV抗体の測定値から推測されるHCV感染の可能性 －ルミパルスによる測定値を用いた健診での分類（2002年時）－ ウィルス血症 感 染 既 往 （稀に交叉反応） 低力価 C.O.I. 1.0～5.0未満 中力価 C.O.I. 5.0～50.0未満 高力価 C.O.I. 50.0以上 C.O.I. ： 検体の発光量÷（標準血清の発光量×0.28）

8 何故Standard Precaution（標準予防策）が必要か？
これら全てから身を守るため 氷山の一角 見えている 感染症 見えていない感染症 未検査 ウィンドウピリオド （潜伏期） 未知の感染症

9 Q A EBウィルス感染の時にマーカーとなる検査はありますか？
Epstein-Barrウィルスは伝染性単核球症を原因ウィルスです。慢性感染時にはBurkittリンパ腫や咽頭癌を引き起こす可能性があります。通常は各種抗体検査（抗EBNA抗体、抗VCA抗体、抗EA抗体)で感染を診断します。 外膜：Viral capsid antigen (VCA) Early antigen (EA) 感染 潜伏期 (30-50日) 急性期 回復期 抗VCA-IgG 抗VCA-IgM EBV-DNA 抗EA-IgG 活動性を反映する 抗EBNA 核内蛋白： Nuclear antigen (EBNA) 抗EBNA － ＋ 抗EA IgG － ＋ －～＋ ＋(高値) 抗VCA IgM － ＋ 抗VCA IgG － ＋ ＋(高値) 病態 感染はない 初感染 既往感染 初感染またはEBVの再活性化 著しいEBVの再活性化

10 Q A 身に覚えがないのに、梅毒に感染している可能性が あると言われました。どうしてでしょう？
梅毒血清反応は、梅毒に対する抗体を検出する検査ですが、 梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum)の菌体成分を抗原とするTPHA法(Treponema pallidum hemaggulutination test)と脂質抗原を用いるSTS法(serological test for syphilis)とがあります。STS法は妊娠、SLEなどの膠原病、ウィルス感染症などでも陽性となることがあります。これを生物学的偽陽性 (biological false positive:BFP)と言います。 TPHA法 陰性 陽性 陰性 陽性 梅毒に感染していない BFP、感染初期 過去に梅毒に感染し治癒 梅毒に感染 STS法 TPHA法：特異性が高い。治療で抗体価は変化しない。 STS法：感度が高い。病勢に伴い抗体価が増減する。

11 Q A インフルエンザウィルスの迅速診断キットがあると聞いたのですが、どういうものでしょうか？
インフルエンザA型あるいはB型の核蛋白に対する抗体を用いたキットが あります。鼻腔または咽頭ぬぐい液中のウィルスを約15分間で検出します。 抗マウス免疫 グロブリン抗体 (ウサギ） 金コロイド標識 抗インフルエンザ 抗体(マウス） 抗インフルエンザ 抗体(マウス） ニトロセルロース膜                                                               判定部 C 判定部 T 検体滴下部 余剰の標識抗体 インフルエンザウィルス抗原 陰性 陽性 金コロイドの色

12 プロカルシトニン 敗血症の診断マーカーとして臨床応用されている。 甲状腺ホルモンであるカルシトニンの前駆体。
通常、血中には存在しないが、細菌感染症の際に全身で 産生が亢進し、血中濃度が上昇する。 細菌感染症に特異性が高い。 抗生剤の適正使用に寄与できるマーカーとして、期待が持たれている。 （抗生剤の投与あるいは中止基準として応用可能か？）

13 感染症 SIRS 外傷 細菌性 真菌性 敗血症 熱傷 ウイルス性 膵炎 ※SIRS： 体温38℃以上、あるいは36℃以下 脈拍90回／分以上
呼吸数増加 白血球数12,000以上ないし4,000以下。あるいは未熟顆粒球10%以上。

14 既存の細菌感染症診断マーカー 白血球数やCRP：細菌感染症に特異性がない。 血液培養： 起因菌が同定された場合の有用性は高い。
血液培養： 起因菌が同定された場合の有用性は高い。 しかし、陽性率が20-30%と低く、皮膚常在菌の コンタミネーションによる偽陽性も多い。 エンドトキシン： グラム陰性菌の検出に有効。

15 Schuetz et al., Curr Opin Crit Care, 2013

16 真菌感染症のマーカー b-Dグルカン 真菌細胞壁の構成成分で、カンジダ属やアスペルギルス属の感染症で
カンジダ抗原 アスペルギルス抗原（ガラクトマンナン抗原）

17 その他にも種々の感染症検査があります。近年、これらの血清検査と 遺伝子検査とを組み合わせて行われることが増えてきています。
病原菌 百日咳菌 Helicobacter pylori レジオネラ菌 A群溶連菌 大腸菌（特にＯ157） 破傷風菌 Clostridium difficile マイコプラズマ カンジダ クラミジア・トラコマティス ムンプスウィルス 麻疹ウィルス 風疹ウィルス 単純ヘルペスウィルス 水痘・帯状疱疹ウィルス サイトメガロウィルス HIV HTLV-Ⅰ 検出物質 百日咳抗体 Helicobacter pylori 抗体 レジオネラ抗体 ASO(antistreptolysin-O) 大腸菌O157抗原、大腸菌ベロトキシン 破傷風抗体 Clostridium difficile産生毒素 (toxin A) マイコプラズマ抗体 カンジダ抗原、(1→3)-β-D-グルカン クラミジア・トラコマティス抗原 ムンプスウィルス抗体 麻疹ウィルス抗体 風疹ウィルス抗体 単純ヘルペスウィルス抗体 水痘・帯状疱疹ウィルス抗体 サイトメガロウィルス抗体 HIV抗原、HIV抗体 HTLV-Ⅰ抗体

18 Q A 低抗体価でも、抗体が検出されれば、特定の 病原体に感染していると考えても良いですよね～！
健常者でも、低抗体価を示す場合がありますので、抗体価だけで判断するのは危険です。少なくとも発病初期と、 発病２～３週間後に採血した血清（ペア血清）で、抗体価 が明らかに上昇していることを確認する必要があります。 64 感染が疑われる 32 病原体Ａに 対する抗体 16 抗体価（倍） 8 発病 4 病原体Ｂに 対する抗体 2 感染の可能性は低い 1 2(週）

19 免疫・血清検査 自己抗体編

20 Q 自己抗体ってなんですか？ A 元来抗体は、病原体や異物抗原が体内に侵入した際に、それを排除する防御機構の一環として産生されるものです。しかし、自己抗体は、自己の体成分に対し反応する抗体のため、その多くは傷害性に働きます。膠原病などの自己免疫疾患の発生、進展に重要な役割を果たしています。 主な自己抗体と関連する疾患 橋本病、Basedow病 悪性貧血 萎縮性胃炎 自己免疫性溶血性貧血 特発性血小板減少症 Addison病 重症筋無力症 Goodpasture症候群 男性不妊症 原発性胆汁性肝硬変症 自己免疫性肝炎 Sjogren症候群 全身性エリテマトーデス（SLE） 多発性筋炎、皮膚筋炎（PM/DM) 強皮症（SSc） 混合性結合織病（MCTD） 慢性関節リウマチ 抗サイログロブリン抗体・抗マイクロゾーム抗体 抗内因子抗体 抗壁細胞抗体 抗赤血球抗体 抗血小板抗体 抗副腎抗体 抗アセチルコリンレセプター抗体 抗基底膜抗体 抗精子抗体 抗ミトコンドリア抗体（AMA） 抗平滑筋抗体 抗SS-A、SS-B抗体 抗dsDNA抗体、抗sm抗体 抗Jo-1抗体 抗Scl-70抗体 抗U1RNP抗体 リウマトイド因子（RF）、抗CCP抗体

21 Q A 自己抗体はどうやって調べるのですか？ では、抗核抗体の検出法で説明しましょう。 蛍光顕微鏡で観察 患者血清 細胞質 Hep-2細胞
（ヒト喉頭癌細胞株） 核 スライドグラス 抗核抗体 FITC標識抗ヒトIgG 免疫グロブリン抗体 蛍光顕微鏡で観察

22 陰性 Peripheral型（辺縁型） Homogeneous型（均等型） 核に均一な蛍光を示しますが、核周辺部により強い蛍光を認めます。 核に均一な蛍光を示し ます。 ・・・・ Discrete Speckled型 （セントロメア型） Speckled型（斑紋型） Nucleolar型（核小体型） 核にざらついた顆粒状の蛍光を認めます。核小体は染色されません。 核小体に蛍光を認め ます。 核に40～80個程の微細な顆粒状の蛍光を認め ます。

23 抗核抗体の染色パターンによって、ある程度抗原と疾患が推測できます。
Peripheral型 Homogeneous型 Speckled型 Nucleolar型 Discrete Speckled型 抗原 DNA DNP Histone U1RNP Sm Scl-70 Jo-1 PM-1 Ku SS-A SS-B PCNA RANA RNA Centromere 疾患と出現頻度 SLE 80～90% SLE 30～70% 薬剤誘発LE 80～100％ MCTD 100% SLE 20～30% SSc 10～20％ PM/DM 20～30% PM/PSS 10% PM/PSS 20～30% Sjs 50～70% Sjs 30～40% SLE 2～3% RA 90～100% PSS 10～20% CREST 70～80% MCTD(混合性結合組織病)はSLE、強皮症(PSS)、PM/DMが重複したものですよね～ なかなか覚え られませ～ん！ CREST：Calcinosis(皮下の石灰沈着)、Raynaud(レイノー)、Esophageal dysmotility (食道蠕動運動低下)、Sclerodactyly(手指硬化症)、Telangiectasia(毛細血管拡張症)

24 チモール混濁試験(TTT)とクンケル混濁試験(ZTT)が自己免疫疾患を
診断するきっかけになることがありますよ～！！ 白濁 チモール飽和 バルビタール緩衝液(TTT) または 硫酸亜鉛 バルビタール緩衝液(ZTT) 吸光度を測定 血清 TTT: IgMと良く相関する ZTT: IgGおよびIgAと良く相関する TTT、ZTTが上昇する疾患としては、 慢性感染症、急性および慢性肝炎、肝硬変 肝細胞癌、多発性骨髄腫、膠原病があります。 乳び血清では高値となるので要注意！

25 各種腫瘍マーカーを測定する際に用いられる免疫学的測定法の 一つです。
ラテックス凝集法 各種腫瘍マーカーを測定する際に用いられる免疫学的測定法の 一つです。 光 透過光 を測定 目的分子 目的分子を介してラテックス粒子が凝集するので、その程度を濁度変化から求めます。 表面に特異抗体を結合 させたラテックス粒子

26 異好抗体による抗体を利用したアッセイ系への干渉
検査に用いられる抗体はマウスやラビットを免疫して作成されたものが殆どですが、人体にはこれらの抗体を認識する異好抗体（heterophilic antibody）が存在することがあります。特にマウスの抗体に反応する異好抗体はHAMA (human anti-mouse antibody)と呼ばれます。 HAMA 例えば、検体中にHAMAが存在すると、 マウスの抗体を結合させたラテックス粒子が、HAMAを介して凝集するため、偽高値を示します。

27 HAMAが陽性となる原因 １．抗体治療を受けたことのある人 ２．動物飼育歴のある人 ３．ワクチンの接種後 ４．輸血歴のある人
原因が不明の場合も 多いのですが…… HAMAが陽性となる原因 １．抗体治療を受けたことのある人 ２．動物飼育歴のある人 ３．ワクチンの接種後 ４．輸血歴のある人 ５．担癌患者さん。

28 再生不良性貧血で発現する 自己抗体の検出

29 再生不良性貧血 厚労省 難治性疾患克服研究事業 臨床調査研究対象“特定疾患” 診断基準：汎血球減少、骨髄中の血球細胞の減少
厚労省　難治性疾患克服研究事業 　　　　臨床調査研究対象“特定疾患” 診断基準：汎血球減少、骨髄中の血球細胞の減少 　　　　　汎血球減少を認める他の疾患を除外する 主な治療法：免疫抑制剤、 　　　　　　副腎皮質ステロイド 　　　　　　骨髄移植 再生不良性貧血（ＡＡ）は、汎血球減少症を呈する症候群である。 診断基準は、血液中の血球数の低下、骨髄の細胞密度の低下、他の血液疾患でないことを確認すること等である。 AAの診断は、基本的に他疾患除外による。 骨髄異形成症候群と不応性貧血と鑑別が困難な症例が多く、AAとこれらの治療内容は全く異なる。 Q：具体的にどう違うのか？ A：AAは、免疫抑制又は骨髄移植、MDSは抗癌剤。 AAの50-70%で免疫抑制剤が奏功することなどから、AAの病態形成に免疫異常が重要な役割を果たしていることが明らかとなっている。 しかし、AAの免疫反応がどの細胞の、どの分子を標的としているかなど、その詳細は不明であった。 一般的に、自己免疫疾患では自己細胞成分に対する多種類の抗体が検出され、その抗体が臨床症状と密接な関係を有する。 そこで、serological identification of antigens by recombinant cDNA expression cloning（SEREX）法を用い、AAで自己抗体が認識する分子の同定を試みた。 AAの免疫異常のマーカーとなる分子（タンパク質）を同定するということである。そして、AAに特異的な診断マーカー及このマーカーを用いる鑑別技術を提供することが可能となった。 研究者らは、ＳＥＲＥＸ法を用いて、ＡＡ患者において自己抗体が認識する抗原分子を同定した。 また、ELIZA法を用いた自己抗体解析により、AAに特異的な自己抗体を同定した。 これらの結果から、次に示す技術を提供できる。 50-70%で免疫抑制剤が奏功⇒免疫異常 免疫反応の標的細胞・分子が不明

30 診断法の課題：MDSや不応性貧血との鑑別が困難
骨髄不全症候群 再生不良性貧血 AA 骨髄異形成症候群（MDS） 鑑別が困難 再生不良性貧血（ＡＡ）は、汎血球減少症を呈する症候群である。 診断基準は、血液中の血球数の低下、骨髄の細胞密度の低下、他の血液疾患でないことを確認すること等である。 AAの診断は、基本的に他疾患除外による。 骨髄異形成症候群と不応性貧血と鑑別が困難な症例が多く、AAとこれらの治療内容は全く異なる。 Q：具体的にどう違うのか？ A：AAは、免疫抑制又は骨髄移植、MDSは抗癌剤。 AAの50-70%で免疫抑制剤が奏功することなどから、AAの病態形成に免疫異常が重要な役割を果たしていることが明らかとなっている。 しかし、AAの免疫反応がどの細胞の、どの分子を標的としているかなど、その詳細は不明であった。 一般的に、自己免疫疾患では自己細胞成分に対する多種類の抗体が検出され、その抗体が臨床症状と密接な関係を有する。 そこで、serological identification of antigens by recombinant cDNA expression cloning（SEREX）法を用い、AAで自己抗体が認識する分子の同定を試みた。 AAの免疫異常のマーカーとなる分子（タンパク質）を同定するということである。そして、AAに特異的な診断マーカー及このマーカーを用いる鑑別技術を提供することが可能となった。 研究者らは、ＳＥＲＥＸ法を用いて、ＡＡ患者において自己抗体が認識する抗原分子を同定した。 また、ELIZA法を用いた自己抗体解析により、AAに特異的な自己抗体を同定した。 これらの結果から、次に示す技術を提供できる。 他の血液疾患と治療法が全く異なる AA:免疫抑制療法、骨髄移植 MDS:抗癌剤治療

31 CoombsとLachmanのアレルギー分類
I型反応： IgEによるアナフィラキシー反応。 II型反応：IgGによる細胞障害性反応。 　　　　 自己免疫性溶血性貧血、ITP etc. III型反応：抗原、抗体や補体の免疫複合体による障害。 　　　　 ループス腎炎、多発性動脈炎 etc. IV型反応：T細胞による障害。 　　　　　多発性硬化症、原発性硬化性胆管炎 etc. 多発性硬化症や原発性硬化性胆管炎でも、 抗MBP抗体や抗ミトコンドリア抗体が産生される！

32 各種疾患での自己抗体保有率 AA患者群は、正常、他疾患群に比べて抗体価が有意に上昇していた。
AA患者の自己抗体陽性率は、RPS27に対する自己抗体の保有率が最も高く、52.2%でした。これに次いで、CLIC1とHSPB11が39.2%、RPL41が26.1%の順に陽性率が高い結果となりました。すなわち、健常者と患者群で抗体価に有意差のあったこれら４分子は、自己抗体陽性率も高いことが確認されました。 ＜詳細＞ １．AA患者では、骨髄ストローマ（HTS-5）よりも、血球細胞に対する自己抗体保有率が高かった。 ２．AA患者血清を用いたSEREX法により、CLIC1、HSPB11、RPL41およびRPS27に対する自己抗体を検出した。 比較し患者群で有意に上昇していました。中でも、RPS27の自己抗体保有率が最も高かった。 ３．IgG型抗CLIC1抗体、抗RPL41抗体および抗RPS27抗体の保有者では、免疫抑制療法に対する反応性が高かった。すなわち、これらの自己抗体価を測定することで、免疫抑制療法の効果を予測することが可能性ではないかと、考えられた。 ＡＡは、血液中の血球数が低下していること、骨髄の細胞密度が低いこと、他の血液疾患でないことを確認すること等によって診断される。これまで、本技術を用いた診断薬開発の例はない。 国内のＡＡ患者数は、約１万人、年間新患者発生数は100万人あたり6人前後。市場規模と想定される研究開発期間の点から、治療薬の有効性を 患者ごとに判定するコンパニオン診断薬として実用化できる可能性が高い。

33 お疲れ～！！