遺伝子導入とクローン技術.

Presentation on theme: "遺伝子導入とクローン技術."— Presentation transcript:

1 遺伝子導入とクローン技術

2 動物細胞を利用した有用物質の生産 １．有用物質生産のストラテジー ヒト遺伝子の動物細胞あるいは組織への導入 Which gene ? Which animal ? How? 遺伝子の発現・遺伝子産物の大量生産 回収・精製

3 受精卵への導入 トランスジェニックアニマル (Transgenic animals) 子孫に伝達される 体細胞（乳腺細胞）への導入 一代限り

4 遺伝情報が（＝遺伝子型, genotype)が 同一の生物（個体群）
クローン(Clone)の定義 　遺伝情報が（＝遺伝子型, genotype)が 　同一の生物（個体群） 伝統的クローン技術 遺伝子操作は 不可能

5 植物のクローン技術

6 植物のカルス培養 この段階で 遺伝子操作が可能 細胞の 脱分化 細胞の 再分化 植物ホルモン処理

7 動物のクローン技術

8 動物の受精卵分割と移植 受精7-8日後 受精卵の分割 発生 100細胞 二分割以上 うまく いかない 仮親１ 仮親２ 遺伝子操作は 不可能
　100細胞 発生 二分割以上 うまく いかない 仮親１ 仮親２ 遺伝子操作は 不可能 妊娠・分娩 妊娠・分娩 ＝

9 核移植 除核 受精卵 遺伝子操作が 可能 ドナー細胞の調整 卵子 ドナー細胞の注入 レシピエント細胞の調整 培養・移植準備
細胞融合と発生の開始

10 仮親 移植

11 幹細胞に類似した細胞の利用による 　　　クローン動物の作製 1996年3月　Campbellら

12 細胞に全能性がある時

13 分化した体細胞からのクローン動物の作製 　　　1997年2月　Campbell ら 分化細胞の脱分化： 　　　　　飢餓培養による細胞周期のG0化

14 細胞周期のG0化 ＝　脱分化

15 細胞周期 Ｍ Ｇ１ Ｓ Ｇ２ 1-7-11 Ｇ２期 Ｍ期 間期 細胞分裂 分裂準備 ２ｈ Ｇ１期 間期 Ｇ０期 ＤＮＡ合成準備期 静止期
Ｓ期 ＤＮＡ合成 １２ｈ Ｇ２期 間期 分裂準備 ２ｈ Ｍ期 細胞分裂 　　　　Ｇ１期 　　　　　間期 ＤＮＡ合成準備期 タンパク合成と 細胞の成長 　　　　　８ｈ Ｇ０期 静止期 Ｍ Ｇ１ Ｓ Ｇ２

16 動物細胞・組織へ遺伝子を導入する技術 形質転換（transformation) 生細胞からの単離ＤＮＡを他の細胞に取り込ませること 形質導入(transduction) ファージによる遺伝物質（ＤＮＡ・ＲＮＡ）の細胞への導入 トランスフェクション (transfection) 動物細胞へ遺伝子を導入すること 遺伝子ターゲティング　(gene targetting) 特定の遺伝子（座）を対象に破壊したり（ノックアウト） 別の遺伝子を組み込んだり（ノックイン）する．

17 動物細胞への遺伝子導入 ①物理化学的方法 ＤＮＡ分子 自然に取り込ませる：エンドサイトーシスの利用 強制的に導入：パーティクルガン 　　　　　　　マイクロインジェクション

18 リン酸カルシウム ＤＮＡ 共沈物 エンドサイトーシス リポフェクション 細胞膜：リン脂質二重膜 脂質人工膜の小球 リポソーム

19 エレクトロポレーション 高電圧のパルス タングステン or 金粒子 パーティクルガン

20 受精卵採取 前核へ遺伝子導入 ② ③ ①　導入効率　低い 　　導入されるコピー数が制御できない 　　導入される場所がランダム（非相同的） ②　導入遺伝子の発現率低い 　　入った場所のプロモーターエンハンサー 　　の支配を受けてしまう　制御が困難 ③　子孫へ伝わる率が低い

21 ②生物学的方法 まず目的遺伝子のクローニング ウィルスへの パッケージング 感染による遺伝子導入 染色体遺伝子と相同組み替え このほか精子の遺伝子をいじり人工受精させる．

22 動物への遺伝子導入 右：ひと成長ホルモン遺伝子を 　　導入したラット 左：対照ラット Science 222巻11/18号（1983）

23 プロモーター 単純に遺伝子を染色体に挿入してもうまくいかない。 RNAポリメラーゼが結合 Poly-A付加 部位 5‘ 転写開始点 TATA
遺伝子調節領域 遺伝子調節領域 mRNA 遺伝子転写調節 タンパクが結合 アクチベーター リプレッサー エンハンサー G-ppp- -AAAAA リボゾーム 結合部位 UAA 　終止コドン AUG 翻訳開始点

24 フュージョン遺伝子の利用 ヒト成長ホルモン遺伝子 5’ 3’ 5’ d 3’ メタロチオネイン遺伝子 及び、それの調節領域 血液中での重金属の運搬タンパク質 5’ d 3’ 食餌に過剰量の銅(Cu)をくわえて、メタロチオネイン遺伝子 を発現誘導すると、下流につないだヒト成長ホルモン遺伝子 も発現させることができる。

25 遺伝子導入のストラテジー c DNAライブラリーから 遺伝子 遺伝子を選択 情報 ベクターへ組み込み 遺伝子導入 生殖細胞 トランスジェニック 受精卵 動物 受精卵へ導入 胚性幹細胞（ES) キメラ動物 物質生産 体細胞 増殖 卵子へ導入 病態モデル クローン化 遺伝子機能確認

26 クローン技術（核移植）と遺伝子操作技術の融合
これまでの手法 兄妹（姉弟）同士の掛け合わせ 　　２０世代以上の交配 ９９％以上の遺伝子組成が一致するようになる ＝純系（かぎりなくクローンに近い） 成熟の遅い動物では適用は非現実的 遺伝子操作が不可能

27

28 体細胞クローン技術の産業的展開 同じ遺伝子型の動物のコピーを大量に作れる 　　　　　　　　　　　　　　　　　可能性がある 遺伝子導入したタンパク質生産用動物の複製 遺伝子導入した臓器移植用動物の複製

29 体細胞クローン技術のポイント どの細胞でもうまくいくとは限らない 　　　　　　分裂増殖の盛んな上皮細胞系の成功率が高い 遺伝子型が完全に一致するとは限らない： 　　　　　　同じ遺伝子が一個であるとは限らない。 　　　　　　複数コピーある遺伝子は、よく変異している。 細胞質遺伝：ミトコンドリアの遺伝物質が 　　　　　　　　　　レシピエント細胞に由来する ゲノムインプリンティングの問題 　　　　　　精子・卵子のもつ遺伝子のメチル化の状況と 　　　　　　G0化した体細胞の遺伝子のメチル化の状況 　　　　　　不一致 異常の発生原因：細胞分裂の紡錘体の形成不全