ゲノム分子生物学1 2008年4月30日　担当: 中東 Terry Brown ゲノム Third Edition 第2章: DNA研究法.

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1 ゲノム分子生物学1 2008年4月30日　担当: 中東 Terry Brown ゲノム Third Edition 第2章: DNA研究法

2 第2章: DNA研究法 2.1 DNA操作に用いられる酵素 2.2 DNAクローニング 2.3 ポリメラーゼ連鎖反応(PCR) ポリメラーゼ
ヌクレアーゼ リガーゼ 修飾酵素 2.2 DNAクローニング クローニングベクター 2.3 ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)

3 2.1 DNA操作に用いられる酵素 ヌクレアーゼ Nuclease リガーゼ Ligase ポリメラーゼ Polymerase
Figure 2.1 Genomes 3 (© Garland Science 2007)

4 2.1.1 DNAポリメラーゼ 鋳型依存的DNAポリメラーゼ
Figure 2.4a Genomes 3 (© Garland Science 2007)

5 鋳型依存的DNAポリメラーゼ Figure 2.5 Genomes 3 (© Garland Science 2007)

6 Figure 2.6a Genomes 3 (© Garland Science 2007)

7 Figure 2.6b Genomes 3 (© Garland Science 2007)

8 DNAの特定領域を合成する >90℃ 37℃ プライマーアニーリング<55℃
Figure Genomes 3 (© Garland Science 2007)

9 繰り返し合成 (1) Figure 2.29 (part 1 of 2) Genomes 3 (© Garland Science 2007)

10 繰り返し合成 (2) Figure 2.29 (part 2 of 2) Genomes 3 (© Garland Science 2007)

11 2.3 ポリメラーゼ連鎖反応(PCR) Figure 2.3 Genomes 3 (© Garland Science 2007)

12 ゲル電気泳動によるPCR産物長の確認 Figure Genomes 3 (© Garland Science 2007)

13 DNAポリメラーゼの持つ活性 Figure 2.7 Genomes 3 (© Garland Science 2007)

14 DNAポリメラーゼの持つ活性 Figure 2.7a Genomes 3 (© Garland Science 2007)

15 DNAポリメラーゼの持つ活性 Figure 2.7b Genomes 3 (© Garland Science 2007)

16 DNAポリメラーゼの持つ活性 Figure 2.7c Genomes 3 (© Garland Science 2007)

17 DNAポリメラーゼI 大腸菌酵素 DNAラベル Tech Note 2.1 Klenow polymerase PolIの5’-3’exo活性を失わせたもの シーケナーゼ T7 DNAポリメラーゼの改変 シーケンス 耐熱性ポリメラーゼ 好熱菌 PCR 逆転写酵素 レトロウィルス cDNA合成 Table 2.1

18 ヌクレアーゼ DNA, RNA, ハイブリッド Figure 2.4b Genomes 3 (© Garland Science 2007)

19 Nucleases available from NEB(New England Biolabs) DNase I (RNase-free)
Exonuclease I (E. coli)   Exonuclease III (E. coli)   Exonuclease T   Lambda Exonuclease   Micrococcal Nuclease   Mung Bean Nuclease   Nuclease BAL-31   RecJf   T7 Exonuclease   Table 2.2 Genomes 3 (© Garland Science 2007)

20 Restriction Nucleases available from NEB(New England Biolabs)
AatII  Acc65I  AccI  AciI  AclI  AcuI  AfeI   AflII  AflIII  AgeI  AhdI  AleI  AluI   AlwI  AlwNI  ApaI  ApaLI  ApeKI  ApoI   AscI  AseI  AsiSI  AvaI  AvaII  AvrII    B BaeGI  BaeI  BamHI  BanI  BanII  BbsI  BbvCI  BbvI  BccI  BceAI  BcgI  BciVI  BclI  BfaI  BfuAI  BfuCI  BglI  BglII  BlpI   Bme1580I  BmgBI  BmrI  BmtI  BpmI  Bpu10I  BpuEI  BsaAI  BsaBI  BsaHI  BsaI  BsaJI  BsaWI  BsaXI  BseRI  BseYI  BsgI  BsiEI   BsiHKAI  BsiWI  BslI  BsmAI  BsmBI  BsmFI  BsmI  BsoBI  Bsp1286I  BspCNI  BspDI  BspEI  BspHI  BspMI  BspQI  BsrBI  BsrDI  BsrFI   BsrGI  BsrI  BssHII  BssKI  BssSI  BstAPI  BstBI  BstEII  BstNI  BstUI  BstXI  BstYI  BstZ17I  Bsu36I  BtgI  BtgZI  BtsCI  BtsI    C Cac8I  ClaI   CspCI   CviAII  CviKI-1   CviQI    D DdeI  DpnI   DpnII   DraI  DraIII   DrdI    E EaeI  EagI  EarI   EciI  EcoNI   EcoO109I  EcoP15I   EcoRI  EcoRV    F FatI  FauI   Fnu4HI   FokI  FseI   FspI    H HaeII  HaeIII  HgaI  HhaI  HincII   HindIII  HinfI  HinP1I  HpaI  HpaII   HphI  Hpy166II  Hpy188I  Hpy188III  Hpy99I HpyAV  HpyCH4III  HpyCH4IV  HpyCH4V     K KasI   KpnI    M MboI  MboII  MfeI  MluI   MlyI  MmeI  MnlI   MscI  MseI  MslI   MspA1I  MspI  MwoI    N NaeI  NarI  NciI  NcoI   NdeI  NgoMIV  NheI  NheI-HF™   NlaIII  NlaIV  NmeAIII  NotI   NruI  NsiI  NspI    P PacI  PaeR7I  PciI  PflFI  PflMI   PhoI  PleI  PmeI  PmlI  PpuMI   PshAI  PsiI  PspGI  PspOMI  PspXI   PstI  PvuI  PvuII  PvuII-HF™    R RsaI   RsrII    S SacI  SacII  SalI  SalI-HF™  SapI  Sau3AI  Sau96I   SbfI  ScaI  ScaI-HF™  ScrFI  SexAI  SfaNI  SfcI   SfiI  SfoI  SgrAI  SmaI  SmlI  SnaBI  SpeI   SphI  SphI-HF™   SspI  StuI  StyD4I  StyI  SwaI    T TaqαI  TfiI  TliI   TseI  Tsp45I   Tsp509I  TspMI   TspRI  Tth111I    X XbaI  XcmI   XhoI   XmaI   XmnI    Z ZraI  

21 Restriction Endonuclease (制限酵素) DNAの特定の配列を認識して切断
Figure 2.9 Genomes 3 (© Garland Science 2007)

22 A B 制限酵素 Restriction Enzyme 制限と修飾 (1950s) Aタイプの細菌で増殖したファージはBタイプの細菌での
増殖を制限される

23 制限酵素 Restriction Enzyme 制限と修飾 (1950s)
一旦Bタイプの細菌で増殖したファージは修飾をうけ、Bタイプの細菌での増殖を制限されなくなる。

24 Restriction Enzyme = Restriction Endonuclease
制限酵素 Restriction Enzyme = Restriction Endonuclease GAATTC 5’ GAATTC 5’ EcoRI 制限酵素 G AATTC 5’ G AATTC 5’

25 Modification Enzyme = Modification Methylase
修飾酵素 Modification Enzyme = Modification Methylase GAATTC 5’ GAATTC 5’ EcoRI 修飾酵素 認識配列2番目のアデニンをメチル化 * GAATTC 5’ GAATTC 5’ * EcoRI 制限酵素 1978ノーベル生理医学賞

26 細胞に注入されたファージDNA 切断（制限）されて分解 制限を免れ、メチル化修飾を受けてファージとして増殖 いずれかの運命をたどる

27 GAATTC GAATTC AATTC G G AATTC AATTC G G AATTC 制限酵素 DNAを特定の箇所で切断
->特定の断片が出来る GAATTC 5’ GAATTC 5’ EcoRI 制限酵素 AATTC G G AATTC AATTC G G AATTC

28 断片の大きさでDNAを区別する アガロースゲル電気泳動
Technical Note 2.2 Figure T2.1 Genomes 3 (© Garland Science 2007)

29 違う濃度のアガロースで泳動した際の分離の差
Technical Note 2.2 Figure T2.2 Genomes 3 (© Garland Science 2007)

30 サザンブロットハイブリダイゼーション Figure Genomes 3 (© Garland Science 2007)

31 サザンブロットハイブリダイゼーション（１）
電気泳動後のゲルからナイロン膜にDNAを転写 Figure 2.11a Genomes 3 (© Garland Science 2007)

32 サザンブロットハイブリダイゼーション（２）
蛍光や放射性同位体などでラベル 同じ配列を持つDNA断片に結合 Figure 2.11b Genomes 3 (© Garland Science 2007)

33 GAATTC GAATTC G AATTC G AATTC G AATTC G AATTC 制限酵素の分子生物学への応用
(DNAクローニング) GAATTC 5’ GAATTC 5’ EcoRI 制限酵素 G AATTC 5’ 5’ G AATTC 5’ 5’ G 5’ どのEcoRI断片もendの 形状は同じ AATTC G 5’ AATTC

34 平滑 粘着 Table 2.3 Genomes 3 (© Garland Science 2007)

35 Figure 2.10a Genomes 3 (© Garland Science 2007)

36 2.1.3 DNAリガーゼ (DNA ligase) Figure 2.4c Genomes 3 (© Garland Science 2007)

37 生体内でのDNAリガーゼの機能はDNA複製、修復で(秋学期)
Figure 2.12a Genomes 3 (© Garland Science 2007)

38 平滑末端のライゲーション (T4 DNA ligase)
Figure 2.12b Genomes 3 (© Garland Science 2007)

39 粘着末端のライゲーション (T4 DNA ligase, E. coli DNA ligase)
Figure 2.12c Genomes 3 (© Garland Science 2007)

40 平滑末端ライゲーション効率と特異性向上のための手法 （１）リンカーの使用
Figure Genomes 3 (© Garland Science 2007)

41 平滑末端ライゲーション効率と特異性向上のための手法 （2）tailing
Figure Genomes 3 (© Garland Science 2007)

42 2.2 DNAクローニング Figure 2.2 Genomes 3 (© Garland Science 2007)

43 大腸菌プラスミドに動物由来DNAをクローニングする(1)
Figure 2.15 (part 1 of 3) Genomes 3 (© Garland Science 2007)

44 大腸菌プラスミドに動物由来DNAをクローニングする(2)
Figure 2.15 (part 2 of 3) Genomes 3 (© Garland Science 2007)

45 大腸菌プラスミドに動物由来DNAをクローニングする(3)
Figure 2.15 (part 3 of 3) Genomes 3 (© Garland Science 2007)

46 1ng =3x108 分子 108 細胞 〜104 形質転換体 Figure 2.16 (part 2 of 2) Genomes 3 (© Garland Science 2007)

47 プラスミドベクターの構造 プラスミドが入った細胞の選択の為の薬剤耐性 大腸菌内での自律増殖に必要なシグナル
外来遺伝子挿入の有無を示すlacZ’遺伝子 外来遺伝子挿入の為の制限酵素切断部位 (MCS) Figure Genomes 3 (© Garland Science 2007)

48 プラスミドDNAの抽出法 (1) Technical Note 2.3 Figure T2.3 Genomes 3 (© Garland Science 2007)

49 プラスミドDNAの抽出法 (2) Technical Note 2.3 Figure T2.4 Genomes 3 (© Garland Science 2007)

50 Figure 2.18 Genomes 3 (© Garland Science 2007)

51 バクテリオファージベクター Figure Genomes 3 (© Garland Science 2007)

52 Figure 2.19 (part 1 of 2) Genomes 3 (© Garland Science 2007)

53 溶菌サイクル 溶源化サイクル Figure 2.19 (part 2 of 2) Genomes 3 (© Garland Science 2007)

54 λファージゲノムのいらない部分を取り去ってベクターとして使う
Figure 2.20a Genomes 3 (© Garland Science 2007)

55 λファージベクター キャプシドにパッケージできるDNAの長さはある範囲で決まっている
Figure 2.20b Genomes 3 (© Garland Science 2007)

56 λファージベクターを使ったクローニング cos-cosがヘッドにパーケージングされる
Figure Genomes 3 (© Garland Science 2007)

57 λファージベクターを使ったクローニング Figure Genomes 3 (© Garland Science 2007)

58 様々なベクターでヒトゲノムを網羅するのに必要なクローン数
Table 2.4 Genomes 3 (© Garland Science 2007)

59 コスミド (cosmid)ベクター λファージ粒子にパーッケージされて感染し、 その後はプラスミドとしてふるまう
その後はプラスミドとしてふるまう　 Figure Genomes 3 (© Garland Science 2007)

60 (Yeast Artificial Chromosome, YAC)
人工染色体ベクター (Yeast Artificial Chromosome, YAC) Figure Genomes 3 (© Garland Science 2007)

61 Figure 2.25 Genomes 3 (© Garland Science 2007)

62 Figure 2.25a Genomes 3 (© Garland Science 2007)

63 Figure 2.25b Genomes 3 (© Garland Science 2007)

64 YAC以外のイーストベクター Figure 2.26a Genomes 3 (© Garland Science 2007)

65 Figure 2.26b Genomes 3 (© Garland Science 2007)

66 Figure 2.27 Genomes 3 (© Garland Science 2007)

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