くろまとぐらふぃー その１.

Presentation on theme: "くろまとぐらふぃー その１."— Presentation transcript:

1 くろまとぐらふぃー その１

2 Михаил Семенович Цвет （ミハイル・セミョーノヴィッチ・ツヴェット）
　　イタリア、ピエモンテ州、アスティ生まれの植物学者。父はロシア人で母はイタリア人であった。1906年にクロマトグラフィーの原理を発見した事で知られる。ジュネーブ大学で物理学・数学を学び、のち植物学に転じた。クロロフィルの研究過程でクロマトグラフィーの方法を発見し1903年に発表した。「クロマトグラフィー」の語は1906年に命名した（偶然ながらロシア語「ツヴェット」もギリシャ語「クロマト」も「色」を意味する）。

3 Chromatography（クロマトグラフィー）とは・・・ 「色の記録」という意味で、
ギリシャ語のChroma（色）とGraphos（記録）を合わせた言葉 ←クロロフィルa ←クロロフィルb ←キサンチン ←カロチン 液体クロマトグラフィーの歴史は２０世紀の初頭、1906年ロシアの植物学者ツヴェットが植物の葉から抽出した色素を分析するために、炭酸カルシウムを詰めたガラス管の上に抽出した色素を置いて、石油エーテルを上から流し続けました。すると時間の経過とともに色素が炭酸カルシウムの間を通って下の方に移動していきますが、最初は一つの層であったものが、徐々に色の異なる４つの層に分かれていく様子が観察されました。 液体クロマトグラフィーの歴史は２０世紀の初頭、1906年ロシアの科学者ツヴェットが植物の葉から抽出した色素を分析するために、炭酸カルシウムを詰めたガラス管の上に抽出した色素を置いて、石油エーテルを上から流し続けました。すると時間の経過とともに色素が炭酸カルシウムの間を通って下の方に移動していきますが、徐々に最初は一つの層であったものが、色の異なる４つの層に分かれていきました。 後の研究でこの4つの層は、青緑がクロロフィルa、黄緑がクロロフィルb、黄色がキサンチン、橙色がカロチンであることが分かりました。 これが液クロの発端となる発見でしたが、実際に色素が分かれて出てくるのに数時間が必要であり、あまり実用的な方法ではありませんでした。液クロが実際に各方面で使用されるようになったのは、さらに半世紀後の1970年代になってからのことです。 「クロマトグラフィ」の「クロマト」は英語で色を意味する言葉で、中国語では「液体クロマトグラフィ」のことを「液相色譜」といいます。

4 身近にあるクロマトグラフィー 川の上流から下流にかけては土砂の粒に応じて段階的に堆積するという現象 自然界のクロマトグラフ
「板べいが長い間、雨ざらしにされると、そこに模様が浮き上がっていた。」 「白い靴を汚してしまったところ、乾燥後 、汚れの模様がついていた。」 川の上流から下流にかけては土砂の粒に応じて段階的に堆積するという現象 川の流れによって流されていく土砂が重力の力を借りて分離 自然界のクロマトグラフ

5 クロマトグラフィーの分離の原理 「移動相中の物質と、固定相の表面との相互作用の違いによって、分離される。」
植物学者ツヴェットの実験では・・・ 炭酸カルシウム・・・・固定相 石油エーテル・・・・・・移動相 　一般的には、 移動相、固定相にどのようなものを用いるか？ どのような物理的・化学的性質の違いによって分離するか？ 　によって、クロマトグラフィーの呼び名が変わってきます。

6 いろいろなクロマトグラフィー 液体クロマトグラフィー（LC） HPLC（高速液体クロマトグラフィー） ガスクロマトグラフィー（GC）
　　 FPLC（中高圧液体クロマトグラフィー） ガスクロマトグラフィー（GC） カラムクロマトグラフィー 薄層クロマトグラフィー（TLC） 超臨界流体クロマトグラフィー（SFC） ペーパークロマトグラフィー 高速向流分配クロマトグラフィー（CCC） パーフュージョンクロマトグラフィーなど

7 HPLCの構成 カラムの充てん剤の種類 ・シリカゲル SiO2 ・ポリマーゲル クロマトグラム
少数ながら使用されているモノとして・・・・セルロース、アガロース、デキストリン、キトサンなどや、セラミックスの1種であるハイドロキシアパタイトやジルコニアなど ポンプはHPLCのシステムの最上流に設置され溶離液瓶中の溶離液をシステムに送り込みます。HPLCの開発当時は最高圧力が高いことが重要でしたが、現在では高圧で使用できることは当然のことで、どのような使用条件でも圧力の変動が少なく、一定の流速で溶離液を流せることが求められています。溶離液の流速が変動すると測定に悪影響を与えます。 　ほとんどのポンプは、ピストン運動のような往復運動を利用しているため、往復運動の周期に応じた周期的な圧力変動（これを脈動といいます）があり、この脈動を減らすための様々な工夫が考案され、現在のポンプは脈動が常に少ないものになっています。しかし、昔では考えられなかったような微量の試料を高感度で分析するようなことも行われており、わずかな流速の変動が測定に影響を与えることもあります。したがって、高感度分析に用いられるポンプにはより高精度なものが必要とされています インジェクタはポンプの次に設置され、ここから分析しようとする試料をシリンジという注射器のようなもので溶離液中に注入します。 なお最近では、多数の試料を連続的に一定間隔で注入することのできる、オートインジェクタ（オートサンプラ）も数多く用いられています。 ツウェットの実験で用いられた、炭酸カルシウムをガラス管に詰めたものと原理的には同じですが、ガラス管ではなくステンレス管のものが用いられ、中に詰められるものとしてはシリカゲルやポリマーゲルなどが用いられています。カラムはこの中で試料の分離が行われるという意味でHPLCシステムの中で最も重要な部品ともいえます。 　HPLCで用いられる溶離液には、酸性のものからアルカリ性ものまで色々な溶離液がありますが、ステンレスは各種溶離液に対する耐食性に優れていますので、HPLC用カラムはほとんどがステンレス製です。しかし、生化学やイオンの試料の分析の場合には試料が金属に触れることが嫌われることがあり、その場合にはガラスカラムが使用されることもあります。 　最近では、新素材であるPEEK（ポリ(エーテルエーテルケトン)樹脂）が、ガラスやステンレスに代わる素材としてHPLC用カラムの主流となるのではないかと言われたこともありました。しかし、PEEKは加工が難しくカラムサイズを一定にすることができませんので、ステンレスカラムが主流という状況は当分変わることがないものと思われます。生化学やイオンの測定にステンレスカラムが本当に悪影響があるのかどうかも不明で、これらの分析用にもステンレスカラムで問題ないという意見も多いようです。 試料の分離はカラムの中で行われますが、分離された結果を見える形に変換するためのものが検出器です。試料が含まれていない溶離液の組成は一定ですが、溶離液に試料中の成分が含まれていると組成が変わってきます。この変化を電気信号として取り出すためのものが検出器で、検出方法の違いによりいくつかのタイプの検出器があります。各検出器の詳細については後で説明します。 検出器で検出された結果は電気信号として出力されますので、まだ目に見える形にはなっていません。これを目に見える形にするために、従来はペンレコーダーのような記録計が用いられてきましたが、現在ではコンピュータを利用したデータ処理器（インテグレータとも言います）が利用されています。データ処理器にはプリンターを内蔵したワープロのような形の簡易型のものから、ディスプレイ、キーボード、プリンターが独立したパソコンのような形のものまで、色々な種類があります。また、最近ではパソコンに使用できるHPLC用のソフトウェアだけを販売している場合もあります。 クロマトグラム

8 HPLCでの分離 a)理想的な分離ピーク（左右対称） b)リーディング c)テーリング 測定時に何か問題がある
Fig.1 a)理想的な分離ピーク（左右対称） b)リーディング c)テーリング 測定時に何か問題がある Fig.2 a)理論段数が高い（数字が大きい）カラム 　　ピークの幅が狭い（性能が良い） b)理論段数が低い（数字が小さい）カラム 　　ピークの幅が広い（性能が良くない） Fig.3 a)分離良好 b)分離やや不良 c)分離不良

9 次回に続く予定です・・・ 理論段数、逆相、順相など・・。 参考文献 http://www.shodex.com/index_ja.html