PAM　と　PAS （腎の染色）.

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1 PAM　と　PAS （腎の染色）

2 PAM　目的 過ヨウ素酸メセナミン銀染色法（Periodic acid-methenamine-silver stain）は、腎糸球体の特殊鍍銀法として、1953年にJones,D,Bによって開発された染色法。 主として、糸球体の基底膜、メサンギウム細胞、細網血管を染めるだけでなく、碑、リンパ節の細網構造、血管壁細胞間物質、間質結合組織の微細な好銀性構築も染色される。 さらに、腎糸球体以外への応用として真菌、細菌、ウイルス粒子やメラニン、ビリルビンに代表される生体内色素や甲状腺コロイド、クロム親和物質などが鍍銀される事が知られ、糸球体基底膜の特殊鍍銀法としての目的だけでなく、多糖体タンパクの特殊染色法として広く用いられている。 Jones原法をHelly液固定組織片に応用した矢島法が広く一般に用いられている。さらにPAM染色は超薄切片を用いた電子顕微鏡的観察も可能。 切片の厚さは２μｍくらいが良い

3 PAM 原理 過ヨウ素酸酸化 OH IO4 アルデヒド基を形成 Ag（NH3）２ 銀鏡反応 H H O O H O H O OH H O H
CHO CHO CHO CHO １、過ヨウ素酸酸化によって多糖類のもつ1,2グリコール基を隣接する２このOH基を開裂してアルデヒド基を形成。 ２、このアルデヒドに明鏡反応によるメセナミン銀が結合する反応。 PAS染色のシッフ試薬の代わりにメセナミン銀を用いる点で基本的には染色原理を共にしている。 過ヨウ素酸酸化なしでも生体内色素、糸球体基底膜、メサンギウム基質がそまる。 PAS反応ほど純化学的なものではなく、PAMは電子荷電を利用する物理化学的な反応に近い。 H Ag（NH3）２ H O O H O H O O 銀鏡反応 COOH COOH COOH COOH + Ag + Ag + Ag + Ag

4 PAM 試薬 1%過ヨウ素酸水溶液 メセナミン銀液 3%メセナミン水溶液 50ml 5%硝酸銀水溶液 5ml 精製水 40ml
4%中性ホルマリン 0.2%塩化金水溶液 ジョーンズ補強液 酸性硬膜定着液 メセナミン銀液は直前に調整し、使用前に６０度に暖めておく。 大谷法では シュウ酸を使用

5 PAM 染色法 シュウ酸 精製水水洗 メセナミン銀液 精製水水洗 ４％中性ホルマリン 精製水水洗 塩化金水溶液 流水水洗 脱パラ・水洗
１％過ヨウ素酸 酸化 鍍銀 鍍銀補強 鍍金 ジョーンズ補強液 シュウ酸 酸性硬膜定着液 ７０・９０・１００％ アルコール キシロール 流水水洗 流水水洗 ヘマトキシリン 流水水洗 エオジン 封入 過ヨウ素酸　１０分 メセナミン銀液　２５分～４０分（５分ごとに様子見） ホルマリン　２～３秒 塩化金　５分 シュウ酸　３～５分 定着 HE染色

6 PAM　注意１ 　メセナミン銀液は58～60℃にああためておくと染色時間を短縮できる。しかし染色の１時間も２時間も前に暖めておくと、銀鏡反応を開始して黒くなってしまうので注意する。 　メセナミン銀による鍍銀が本染色のもっとも重要なポイントであり、反応時間は１時間を目安にし、切片が黄褐色になったところを見計らって鏡検する。そのさい、太めの血管の基底膜が先に染まり、次に尿細管基底膜が黒化し、さらに糸球体内の毛細血管基底膜が十分に黒化したのを確認して鍍銀を終了するといい。 　矢島法はメセナミン銀液の反応温度が高く、反応が終末点に近づくと急激に黒化し、非特異的なメセナミン銀の沈着や共染がおこるので、慣れないうちは黄褐色になった時点で室温、あるいは孵卵器で反応させると鍍銀状態を判断しやすい。 　銀液による反応は塩化金で黒化した基底膜の染色性がやや落ちるので過染気味に染めた法が良い。 銀メッキの反応を「銀鏡反応」という。 鏡の反射面 などに使用される。

7 PAM 注意２ メセナミン銀液による鍍銀のさい、金属ピンセット等を使用すると銀鏡反応が起こるので注意する。
　メセナミン銀液による鍍銀のさい、金属ピンセット等を使用すると銀鏡反応が起こるので注意する。 　メセナミン銀液にごくわずかなゼラチンを溶かして鍍銀を行うと過剰な銀鏡反応を防ぐ事ができ、スライドガラスに銀液が付着するのを防ぐ事ができる。 　4%中性ホルマリン水はJones原法では使用されず、実際省略しても染色性に差はない。矢島は染色を翌日にまわす時に蒸留水に長く留めておくと鍍銀された基底膜などの反応産物が変色することがあるので、この変色の防止という意味で用いている。 　PAM染色後のHE染色は銀をのせた上に染色するので、通常の切片を染色するより時間がかかる。また、後染色としてアザン染色やマッソン染色を用いても良い。 １％ゼラチン水溶液　１滴 （現在使う人は少ない）

8 PAM　染色結果 基底膜、細網線維 黒褐色 膠原線維 褐色 赤血球 赤色 PAS陽性物質 淡紅色

9 PAS　目的 PAS反応（過ヨウ素酸シッフ染色 / Periodic acid Schiff reaction）はMcManus(1946)、Hotchkiss(1948)らによって、多糖類の組織化学的証明法として発展し、現在では肝臓のグリコゲン、消化管の粘液物質の証明、色素顆粒や細胞顆粒、真菌、アメーバの識別および腎糸球体病変の識別等、広く糖質の一般染色として知られている。 イメージ H 原理はまだ完全に解明されていないが、糖質を過ヨウ素酸で酸化し、生じたアルデヒド基がシッフ試薬と結合して、赤紫色の化合物を形成する反応を利用したもの。 O 切片の厚さは、腎１μｍ、その他３μｍ。 H O O CHO CHO 　　　+ シッフ試薬 　　　+ シッフ試薬

10 PAS 試薬 0.5%過ヨウ素酸水溶液 シッフ試薬 hot schiff cold schiff 亜硫酸水 10%重亜硫酸ナトリウム 6ml
　0.5%過ヨウ素酸水溶液 　シッフ試薬 　　　　hot schiff cold schiff 　亜硫酸水　 　　　　10%重亜硫酸ナトリウム　6ml 　　　　1N塩酸　5ml　 　　　　精製水　100ml シッフ試薬使用液は容器の密封に注意し、冷暗所保存でも約１ヶ月を期限とし、赤味を帯びてくれば使用してはならない。 シッフ試薬は従来からhotが用いられてきたが、近年より良好な方法としてcoldが検討されている。

11 PAS 染色法 脱パラ・水洗 過ヨウ素酸水溶液 精製水水洗 シッフ試薬 亜硫酸水×３回 流水水洗 ヘマトキシリン 流水水洗 脱水・封入 酸化
過ヨウ素酸　５分 シッフ　２０分 亜硫酸　３分×３（液は４回分） ヘマトキシリン　２０秒 酸化 呈色 洗浄 核染

12 PAS 注意 脱パラ後の流水は、水洗により糖質が拡散、溶出するおそれがあるため、長く水洗しないこと。
　脱パラ後の流水は、水洗により糖質が拡散、溶出するおそれがあるため、長く水洗しないこと。 　過ヨウ素酸で酸化を行う場合には、適する温度、時間があり、一定範囲外では反応は非特異的になるといわれている。過ヨウ素酸は毎回新調し、常温で１５分をこえないようにすること。 　シッフ試薬は染色する時に亜硫酸ガスのにおいがなければよく染まらない。また、試薬の汚染を防ぐために標本の水分をよく除去すること。 　亜硫酸水は毎回新調し、シッフ試薬から直接水洗せずに亜硫酸水へ移すこと。 　核染色はPAS反応により核酸が酸化されて塩基性色素に親和性が増しているので、染色時間は普通のときより短くていい。

13 グリコゲン、中性粘液多糖類、糖蛋白、粘液蛋白、糖脂質
PAS　染色結果 グリコゲン、中性粘液多糖類、糖蛋白、粘液蛋白、糖脂質 　　　　　 赤紫色 陽性細胞 細胞内グリコゲンや粘液,卵巣の濾胞液,軟骨基質,甲状腺コロイド,副腎のクロム親和性物質,下垂体の腺細胞の顆粒,リポフスチン,腎糸球体や尿細管基底膜や硝子滴,小血管のフィブリノイド変性や硝子化,前立腺内容,脾やリンパ節の細網線維や小血管,好中球,肥満細胞,骨髄巨細胞,赤痢アメーバ,真菌類,細菌類