LC/MSによる環境汚染物質の分析条件の検討. －マネブ系農薬・界面活性剤の分析－

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1 LC/MSによる環境汚染物質の分析条件の検討. －マネブ系農薬・界面活性剤の分析－
＜目的＞ 古くから農薬として使用されているエチレンビスジチオカーバメート系農薬（マネブ、ジネブ、マンゼブ）は、環境ホルモン物質であると共に、PRTR法の対象物質に列挙されている。これらマネブ類の環境汚染の状況を把握するため、近年環境分析への適用が提唱されている液体クロマトグラフ／質量分析計（ＬＣ／ＭＳ）を用いて、水質、底質及び大気試料を対象とした分析法を開発する。また、カチオン性界面活性剤として、繊維柔軟剤や整髪料に含有され、環境水への流出が懸念されている長鎖アルキル基を有する４級アンモニウム化合物のLC/MS法による分析について、基礎的な条件検討を行う。

2 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）
N,N’-ethylenebis(dithiocarbamate) fungicides 生産量：ジネブ 395t，マネブ 1,682t，マンゼブ 2,556t （’93，輸入量も全て同程度） 用 途：殺菌剤。マネブはジネブより適用範囲が広く、殺菌性、薬効、 薬害もマネブが強い。マンゼブは、マネブに水溶性亜鉛を反 応させて生成。殺菌性はマネブと同等で薬害が少ない。化学的 には混合物ではなく亜鉛イオン配位マネブと判定されている。 溶解性：ほとんどの有機溶媒に不溶 その他：環境ホルモン（モニタリング不能物質群） PRTR法第1種指定化学物質 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）

3 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）
分析法の概要 MW = 240 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）

4 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）
分 析 方 法 水質試料 200mL ← L-ｼｽﾃｨﾝ 1g ← アルカリ性EDTA溶液 100mL 振とう 15分 ← イオン対試薬* 15mL 中 和 ･･ 2M 塩酸 抽 出 ･･ 0.1M CH3I/CHCl3-hexane(3:1) 50mL×２ 誘導体化 ･･ 室温，30分静置 濃縮・溶媒転溶 ･･ CH3CN 1mL クリーンアップ ＬＣ／ＭＳ 分析 底質試料 5g 精製 200mL ← L-ｼｽﾃｨﾝ １g ← イオン対試薬* 5mL 大気試料（Hi-Vol ろ紙） *) イオン対試薬 ： 0.41M 硫酸水素 テトラブチルアンモニウム水溶液 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）

5 Dimethyl Ethylenebis(dithiocarbamate) [EBD-dimethyl]：定量用標準品の合成
エチレンジアミン（NH2CH2CH2NH2) 96%エタノール中 ← CS2, CH3I 攪 拌 ← 水 沈 殿 再結晶（クロロホルム，2回） 融点測定結果： ℃ 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）

6 EBD-dimethylのLC/MS測定条件
（HPLC） カ ラ ム : Inertsil ODS-80A， 1.5mm id, 250mm， 5μm 移動相 : CH3CN/水(6:4)→ (10分) →100%CH3CN (20分) 流速 ： 0.1 mL/min , 注入量 : １μL カラム温度: 30℃ （MS） 装 置 : プラットフォーム LCZ（Waters社） モード : ESI，負イオンSIM測定 窒 素: 346 L/hr. 温 度 : 脱溶媒 100℃, イオン源 80℃ 電 圧 : ｻﾝﾌﾟﾙコーン 10V, キャピラリー 3.0kV, マルチプライアー 660V モニターイオン ： m/z 239 (M-H) & 191，241 (M+H) 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）

7 EBD-dimethyl標準品の マススペクトル及びマスクロマトグラム
(-) (+) (-) (-) 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）

8 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）
検 量 線 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）

9 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）
装置検出限界の測定 S/N=7.9 代表的なクロマトグラム 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）

10 クリーンアップ条件の検討 （Sep-PAK C18からの溶出パターン）
50 100 Fr1 Fr2 Fr3 Fr4 Fr5 [%] CH3CN 20%水/CH3CN 60%水/CH3CN 分画：各4mL 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）

11 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）
物質毎の回収率 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）

12 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）
添加回収試験結果 試 料 ｎ 添加後 濃度 平均回 収率 [%] 標準偏差 精製水 500mL ５ 0.2ppb 86.3 26.3 海水 ２ 2ppb 109% － 大気 250m 3 4ng/m 93% 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）

13 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）
精製水添加試料の SIMクロマトグラム 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）

14 カチオン性界面活性剤 （4級アンモニウム化合物）の分析 I
化合物名 略号 示性式 分子量／検出イオン 1. n - デシルトリメチルアンモニウム DTMA [CH3(CH２）9N (CH3)3] / 200 ブロミド Br - 2. n - ドデシルトリメチルアンモニウム DDTMA [CH3(CH２）11N (CH3)3] / 228 クロリド Cl - 3. セチルトリメチルアンモニウム CTMA [CH3(CH２）15N (CH3)3] / 284 ブロミド Br － 4. テトラデシルジメチルベンジルアンモニウム TDDMBA [CH3(CH２）13N (CH3)2 CH2C6H5] / 332 5. ステアリルトリメチルアンモニウム STMA [CH3(CH２）17N (CH3)3] / 312 6. セチルジメチルベンジルアンモニウム CDMBA [CH3(CH２）15N (CH3)2 CH2C6H5] / 360 7. ジ－ n - ドデシルジメチルアンモニウム DDDDMA [[CH3(CH２）11]2N (CH3)2]] / 382 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）

15 4級アンモニウム化合物のLC/MS測定条件 (酢酸アンモニウム系 )
（HPLC） カ ラ ム : MSpak GF-310 4D， 4.6 mm id, 150mm， 6μm 移動相 : CH3CN/5mM 酢酸アンモニウム＋0.3% ギ酸 (25:75)→ (7分) → 35% CH3CN(18分） 流速 ： 0.25 mL/min , 注入量 : 20μL カラム温度: 40℃ （MS） 装 置 : ZQ（Waters社） モード : ESI，正イオン Scan/SIM測定 窒 素: 595 L/hr. 温 度 : 脱溶媒 175 ℃, イオン源 70℃ 電 圧 : ｻﾝﾌﾟﾙコーン 39 V, キャピラリー 3.1kV, マルチプライアー 650V 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）

16 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）
7種 4級アンモニウム化合物 （1uM) のTIC １ 2 1. DTMA 2. DDTMA 3. CTMA 4. TDDMBA 5. STMA 6. CDMBA 7. DDDDMA 4 3 6 5 7 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）

17 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）
7種 4級アンモニウム化合物 （0.1nM) のSIM 1. DTMA 5. STMA 4. TDDMBA 3. CTMA 2. DDTMA 6. CDMBA 7. DDDDMA 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）

18 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）
7種 4級アンモニウム化合物分析法の評価 化合物名 検量線直線性* 標準偏差 ** 再現性 ** （σ） (%RSD) 1. DTMA 2. DDTMA 3. CTMA 4. TDDMBA 5. STMA 6. CDMBA 7. DDDDMA LOD (3σ） nM LOQ (10σ） nM * 0.1nM - 1 uM ** 1nM x 9回 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）

19 カチオン性界面活性剤 （4級アンモニウム化合物）の分析 II
化合物名 略号 示性式 分子量／検出イオン 1. n - デシルトリメチルアンモニウム DTMA [CH3(CH２）9N (CH3)3] / 200 ブロミド Br - 2. n - ドデシルトリメチルアンモニウム DDTMA [CH3(CH２）11N (CH3)3] / 228 クロリド Cl - 3. n - テトラデシルトリメチルアンモニウム TDTMA [CH3(CH２）13N (CH3)3] / 256 4. セチルトリメチルアンモニウム CTMA [CH3(CH２）15N (CH3)3] / 284 ブロミド Br － 5. テトラデシルジメチルベンジルアンモニウム TDDMBA [CH3(CH２）13N (CH3)2 CH2C6H5] / 332 6. ステアリルトリメチルアンモニウム STMA [CH3(CH２）17N (CH3)3] / 312 7. セチルジメチルベンジルアンモニウム CDMBA [CH3(CH２）15N (CH3)2 CH2C6H5] / 360 8. ジ－ n - ドデシルジメチルアンモニウム DDDDMA [[CH3(CH２）11]2N (CH3)2]] / 382 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）

20 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）
8種 4級アンモニウム化合物 （1uM) のTIC 2.50 5.00 7.50 10.00 12.50 15.00 17.50 20.00 22.50 Time 100 % AA_std_DIW_scan1 1: Scan ES+ 6.69 7.97 10.01 12.61 14.37 15.31 17.15 19.29 1. DTMA 2. DDTMA 3. TDTMA 4. CTMA 5. TDDMBA 6. STMA 7. CDMBA 8. DDDDMA 1 2 3 4 5 6 7 8 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）

21 8種 4級アンモニウム化合物 （1uM) のﾏｽｽﾍﾟｸﾄﾙ
200 250 300 350 400 m/z 100 % AA_std_DIW_scan1 338 (6.750) 1: Scan ES+ 4.13e7 201 AA_std_DIW_scan1 405 (8.090) 228 229 AA_std_DIW_scan1 504 (10.070) 256 257 AA_std_DIW_scan1 630 (12.590) 284 285 AA_std_DIW_scan1 723 (14.450) 332 240 333 AA_std_DIW_scan1 768 (15.350) 312 313 AA_std_DIW_scan1 858 (17.150) 360 361 AA_std_DIW_scan1 970 (19.390) 382 383 1. DTMA 5. TDDMBA 2. DDTMA 3. TDTMA 4. CTMA 6. STMA 7. CDMBA 8. DDDDMA 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）

22 8種 4級アンモニウム化合物 0.1%SDS添加（1uM) のTIC
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 Time 100 % AA_DIW_00 1: Scan ES+ 8.04 228 6.64 200 10.33 256 15.85 312 13.07 284 14.89 332 17.72 360 19.92 382 AA_SDS_00 10.47 8.10 7.72 4.96 227 10.09 15.78 13.33 12.77 14.87 19.82 17.64 2: Scan ES- 14.20 265 14.32 14.72 15.08 15.39 18.27 293 1. DTMA 2. DDTMA 3. TDTMA 4. CTMA 5. TDDMBA 6. STMA 7. CDMBA 8. DDDDMA 1 2 3 4 5 6 7 8 0.1% SDS 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）

23 4級アンモニウム化合物のLC/MS測定条件 (改善系 )
（HPLC） カ ラ ム : MSpak GF-310 4D， 4.6 mm id, 150mm， 6μm 移動相 : CH3CN/0.4mM 4,4’-Bipyridyl＋0.8mM 塩酸 (35:65)→ (7分) → 45% CH3CN(25分） 流速 ： 0.25 mL/min , 注入量 : 20μL カラム温度: 40℃ （MS） 装 置 : ZQ（Waters社） モード : ESI，正イオン Scan/SIM測定 窒 素: 595 L/hr. 温 度 : 脱溶媒 175 ℃, イオン源 70℃ 電 圧 : ｻﾝﾌﾟﾙコーン 39 V, キャピラリー 3.1kV, マルチプライアー 650V 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）

24 8種 4級アンモニウム化合物 （1uM) のTIC (改善系 )
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 Time 2 100 % BPY_DIW_01 1: Scan ES+ 6.34 4.68 7.06 12.59 11.63 9.91 13.95 15.80 1. DTMA 2. DDTMA 3. TDTMA 4. CTMA 5. TDDMBA 6. STMA 7. CDMBA 8. DDDDMA 1 3 4 5 6 7 8 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）

25 8種 4級アンモニウム化合物 （1uM) のﾏｽｽﾍﾟｸﾄﾙ (改善系 )
200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 m/z 100 % BPY_DIW_ (11.629) 1: Scan ES+ 1.52e7 332 199 333 BPY_DIW_ (12.651) 312 313 BPY_DIW_ (14.013) 360 361 BPY_DIW_ (15.776) 382 383 1. DTMA 5. TDDMBA 2. DDTMA 3. TDTMA 4. CTMA 6. STMA 7. CDMBA 8. DDDDMA 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）

26 8種 4級アンモニウム化合物 0.1%SDS添加（1uM) のTIC (改善系 )
5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 Time 100 % 3 2 BPY_DIW_01 1: Scan ES+ BPI 1.46e7 6.34 228 4.68 200 7.06 256 12.59 312 11.63 332 9.91 284 13.95 360 15.80 382 BPY_SDS_01 1.48e7 6.32 4.92 4.54 12.77 11.81 7.32 10.23 14.09 15.90 2: Scan ES- 6.52e7 31.06 265 15.65 293 1. DTMA 2. DDTMA 3. TDTMA 4. CTMA 5. TDDMBA 6. STMA 7. CDMBA 8. DDDDMA 2 6 5 7 4 8 1 3 0.1% SDS 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）

27 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）
SDS添加による再現性の変化 化合物名 SDS無添加 1: DTMA Average StDev %RSD 9.33 2: DDTMA Average StDev %RSD 9.35 3: TDTMA Average StDev %RSD 11.75 4: CTMA Average StDev %RSD 11.78 5: TDDMBA Average StDev %RSD 10.56 6: STMA Average StDev %RSD 7.02 7: CDMBA Average StDev 79061 %RSD 4.46 8: DDDDMA Average StDev 50107 %RSD 5.73 0.1% SDS 添加 167361 9.85 231014 11.25 245065 8.80 158124 6.88 201878 8.11 273099 10.71 196774 8.53 221971 11.85 各成分1uM 含有の標準溶液に0.1% SDS 添加／無添加のN=5 Scan mode 分析より算出 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）

28 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）
まとめ （１） ： マネブ類の分析 LC/MSを用いた環境試料中のマネブ、ジネブ及びマンゼブの分析法開発を試みた結果、以下の知見が得られた。 １．LC/MSでのマネブ類の装置検出限界は、0.019μg/mLであった。 ２．この値は、水質試料では0.038ppb、大気試料では0.076ng/m3に 相当し、十分環境分析に適用可能な濃度レベルであった。 ３．物質毎の回収率は 84.8～102% であり、物質間の差はなかった。 ４．精製水を用いた低濃度添加回収試験では、平均回収率が86.3%と 良好な値が得られた。 ５．しかし、内標準等が用いられないため、相対標準偏差 は26.3%と 比較的大きく、測定値にばらつきが見られた。 ６．マネブ類をヨウ化メチルで誘導体化することにより、高感度の環境 分析を実施することが出来る。 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）

29 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）
まとめ （２） ： カチオン性界面活性剤の分析 LC/MSを用いたカチオン性界面活性剤の一種である長鎖アルキル基を有する4級アンモニウム化合物の分析法について酢酸アンモニウムを移動相として検討し、以下の知見が得られた。 1. LC/MSでの4級アンモニウム化合物の検出限界及び定量限界は、 それぞれ , nMであった。 ２．本法による nM における検量線の直線性はいずれの化 合物も 0.99 < と良好な値が得られた。 ３．しかし、実試料を想定した 0.1% SDS 添加溶液においてSDS溶出 部の成分に感度低下等の著しい影響が認められた。 ４．今後の課題として、SDS添加の影響が比較的少ない改善系での分 析法の検討と実試料による評価が挙げられる。 第4回日本水環境学会MS技術研究委員会シンポジウム (2001,九州国際大学）