薬品分析学３.

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1 薬品分析学３

2 演習 HPLCの構成要素を順番に並べなさい。 ポンプ 記録計 カラム 圧力計 検出器 溶媒(移動相液体)の瓶 試料導入部(インジェクター)

3 光学分割 (鏡像異性体の分離) 鏡像異性体 (対掌体): エナンチオマー (enantiomer) 旋光度以外の物性が同じ
通常のカラムで分離不能

4 ジアステレオマー (diastereomer)
ジアステレオマー＆エナンチオマー 不斉中心が2つ以上ある化合物 エナンチオマー (enantiomer) 立体異性体 ジアステレオマー (diastereomer) 3-クロロ-2-ブタノール (Fischer 投影式) CH3 H OH Cl * * S * * R

5 ジアステレオマー＆エナンチオマー ジアステレオマー (diastereomer) 不斉中心が2つ以上ある化合物にしかジアステレオマーは
存在しない 不斉中心が2つ以上ある化合物の異性体 CH3 H OH Cl S R * CH3 Cl HO H R S * エナンチオマー (enantiomer) の関係 対称面 ジアステレオマー (diastereomer) の関係 エナンチオマー以外の関係

6 ジアステレオマー＆エナンチオマー 3-クロロ-2-ブタノール (Fischer 投影式) エナンチオマー (enantiomer) の関係
OH Cl CH3 H HO Cl S * * R * * R ジアステレオマー (diastereomer) の関係 CH3 Cl H OH CH3 Cl HO H ジアステレオマー 別化合物 * * S R S * * 通常クロマトグラフィー で分別可能

7 クロマトグラフィーによる光学分割 キラル固定相法 キラル化合物(分離対象) R R R R R S S R R R R R S R R R
キラル化合物(固定相) キラル移動相法 R R R S S R R R R R S R R R R R R 固定相 R 固定相 S R R S R キラル化合物(移動相)

8 ジアステレオマー(diastereomer)の関係
クロマトグラフィーによる光学分割 ジアステレオマー法 R S R R S R R R R S R 固定相 固定相 R R R S R R 固定相 R R S 共有結合形成 キラル化合物 R R S 化学反応 通常クロマトグラフィー で分別可能 + R S R R 別化合物 ジアステレオマー(diastereomer)の関係

9 ジアステレオマー：例 グルコース マンノース ガラクトース 環状構造 還元型構造 * * * Fischer 投影式 * * * * * *
融点 α:146 ℃ / β:150 ℃ 132～133℃ α:167 ℃ / β: ℃ 甘味度(vsショ糖) 0.69 0.59 0.63 ジアステレオマー の関係 ジアステレオマー 別化合物 通常クロマトグラフィー で分別可能

10 ジアステレオマー(diastereomer)
クロマトグラフィーによる光学分割 キラル固定相法 R R R R R R R R R R R R 右足には右足用の靴 キラル移動相法 R R 別物 R S 通常クロマトグラフィー で分別可能 ジアステレオマー(diastereomer) 的な関係

11 キラル固定相法・キラル移動相法に用いられるキラル化合物
教科書 P183 図3-35

12 宿題(締切: 6/11(木)，田中の部屋の前のカゴ)
演習 HPLCの構成要素を順番に並べなさい。 ポンプ 記録計 カラム 圧力計 検出器 溶媒(移動相液体)の瓶 試料導入部(インジェクター) 宿題(締切: 6/11(木)，田中の部屋の前のカゴ) 以下の物質から「原理的にキラル固定相になるもの」と「原 理的にキラル移動相になるもの」をそれぞれ選びなさい。 ベンゼン グルコース アルブミン ポリエチレングリコール オクタデシルシリル基 シクロヘキサン ろ紙 プロリン

13 宿題(締切: 6/11(木)，田中の部屋の前のカゴ)
以下の物質から「原理的にキラル固定相になるもの」と「原 理的にキラル移動相になるもの」をそれぞれ選びなさい。 ベンゼン グルコース アルブミン ポリエチレングリコール オクタデシルシリル基 シクロヘキサン ろ紙 プロリン キラル固定相になるもの: グルコース アルブミン ろ紙 プロリン 不斉(キラル)中心を有した化合物 キラル移動相になるもの: グルコース アルブミン プロリン 不斉(キラル)中心を有した化合物、かつ、溶媒に溶解する物質

14 電気泳動 電気泳動装置(ポリアクリルアミドゲル) パワーサプライ(電源装置) 出典 Wikipedia「ポリアクリルアミド電気泳動」 出典

15 ポリアクリルアミドゲル ポリアクリルアミドゲル ポリアクリルアミドゲル化学構造
出典: /stbiol/protocols/SDS_PAGE.pdf ポリアクリルアミドゲル化学構造

16 電気泳動(アガロースゲル) 電気泳動装置(アガロースゲル) パワーサプライ(電源装置)
出典: 教科書P218 図3-56 注意: 教科書の図3-56(b) の図はアガロースゲル電気泳動槽の図

17 アガロースゲル アガロースゲル アガロース: 寒天の主成分 上記単位構造が連なっ た多糖類(ポリサッカラ イド) 見ての通り寒天だ！
　　　寒天の主成分 上記単位構造が連なっ た多糖類(ポリサッカラ イド) 見ての通り寒天だ！ 出典: blog-date html

18 ポリアクリルアミドゲル/アガロースゲル アガロースゲル ポリアクリルアミドゲル ポリマー(長鎖化合物)がからまって固まったもの
電荷が同じなら − ゲルの網目を抜けでる速さ >> 分子ふるい効果 分子量の小さな分子が早く 泳動される ゲルろ過と逆 分子量が同じなら電荷の大 きな分子が早く泳動される +

19 電気泳動速度 移動速度 v: 移動速度; μ: 移動度; V: 電圧; L: 電極間距離; E: 電場強度 移動度
Q: 化合物電荷; π: 3.14•••; η: 溶媒粘度; r: 化合物半径 化合物半径 r ↑ 移動度 μ ↓ (μ ∝ 1/r) 化合物が大きくなると、泳動速度が遅くなる 化合物電荷 Q ↑ 移動度 μ ↑ (μ ∝ Q) 溶媒粘度 η ↑ 移動度 μ ↓ (μ ∝ 1/η)

20 ポリアクリルアミドゲル/アガロースゲル: 応用
核酸の鎖長決定 (プラスミド等) 核酸の鎖長決定 蛋白質の分子量決定 蛋白質の等電点決定 − − 核酸−蛋白質の結合定数決定 疎水性コア 蛋白質の構造形成原理 − + −

21 ポリアクリルアミドゲル: SDS-PAGE
負電荷 − SDS: sodium dodecyl sulfate (界面活性剤) 　　 別名：ラウリル硫酸ナトリウム = = 蛋白質の変性剤 PAGE: PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 　　　 (ポリアクリルアミドゲル電気泳動) 長鎖脂肪鎖 (疎水性) − − − − − − − − − 蛋白質側鎖 − 蛋白質主鎖 蛋白質の構造を崩す 分子量に依存した長さ(大きさ) 鎖長に応じた泳動度 蛋白質の分子量決定

22 キャピラリー電気泳動 装置概略 キャピラリー: フューズドシリカ(溶融石英)をポリイミドでコート
電源: 高圧電源 (10k〜30kV, 250 μA 以下) 検出器: 紫外吸光度(UV)検出器、フォトダイオードアレイ検出器 資料注入: 落差法(サイホン)、吸引法、加圧法、(電気)泳動法

23 キャピラリー電気泳動：分類 キャピラリーゾーン電気泳動 支持体：なし(電解質溶液)
泳動の駆動力：電気浸透流(電荷(+,N,−)に関わらず陰極側へ) 泳動速度：陽イオン > 中性物質 > 陰イオン Si O Si O Si O− OH O− − + + 電気浸透流 電気浸透流の元 電気二重層 壁近傍の陽イオンの流れが駆動力 泳動界面が平ら 高分離能のクロマトグラフィー(電気泳動)

24 キャピラリー電気泳動：分類 キャピラリーゲル電気泳動 支持体：あり(ポリアクリルアミド、アガロース等) 泳動の駆動力：静電引力
泳動速度：分子ふるい効果(大きな分子が遅い) キャピラリー中のゲル電気泳動

25 キャピラリー電気泳動：分類 ミセル動電クロマトグラフィー 泳動液：イオン性ミセル添加電解溶液 泳動の駆動力：電気浸透流(ミセルの泳動は遅い)
泳動速度：ミセル相と水相との分配平衡 ミセル相に取込まれやすい化合物の泳動が遅れる

26 キャピラリー電気泳動：応用 DNA塩基配列解析(シーケンシング) キャピラリーゲル電気泳動 どちらか不明 キャピラリーゾーン電気泳動
生命科学(ゲノム配列解析)を飛躍的に進めた装置

27 演習 化合物(a)〜(c)のうち、四角で囲んだ化合物と「キラル固定相法」 「キラル移動相法」等の光学分割が必要な化合物と、通常カラム
(b) (c) CH3 H OH Cl CH3 H HO Cl CH3 Cl H OH CH3 Cl HO H S * * * * R S R S * * * * R 光学分割が必要な化合物： 通常カラムで分離可能な化合物：

28 宿題(締切: 6/18(木)，田中の部屋の前のカゴ)
分子(a)〜(c)の、電気泳動での移動速度の順番を答えなさい。 (a) 電荷価数: -5, 半径: 9 nmの球 (b) 電荷価数: -1, 半径: 3 nmの球 (c) 電荷価数: -2, 半径: 60×10-10 mの球 分子(d)〜(f)の、電気泳動での移動速度の順番を答えなさい。 ただし球状蛋白質の密度は全て同じで、蛋白質は完全な球体 であるものとする。 (d) 電荷価数: -5, 分子量: 9000の球状蛋白質 (e) 電荷価数: -4, 分子量: 12000の球状蛋白質 (f) 電荷価数: -6, 分子量: 15000の球状蛋白質

29 宿題(締切: 6/18(木)，田中の部屋の前のカゴ)
分子(a)〜(c)の、電気泳動での移動速度の順番を答えなさい。 e: 電子1個の電荷 -1.602×10-19 (C) (a) 電荷価数: −5, 半径: 9 nmの球 (5e) 5e 移動度 = = 6πη×9 54πη クーロン (b) 電荷価数: −1, 半径: 3 nmの球 (1×e) e 3e 移動度 = = = 6πη×3 18πη 54πη (c) 電荷価数: −2, 半径: 60×10-10 mの球 60×10-10 m = 6×10-9 m = 6 nm (2e) e 3e 移動度 = = = 6πη×6 18πη 54πη 答　(a) > (b) ≈ (c)

30 宿題(締切: 6/18(木)，田中の部屋の前のカゴ)
分子(d)〜(f)の、電気泳動での移動速度の順番を答えなさい。 ただし球状蛋白質の密度は全て同じで、蛋白質は完全な球体 であるものとする。 単位(C) 移動度 単位(m) (d) 電荷価数: -5, 分子量: 9000の球状蛋白質 単位(g/mol = g•mol-1) 分子1 molの質量 分子量 ≠ 半径 ( r に分子量を代入してはダメ!) ただし、分子量と半径 r には一定の関係がある(関数関係) 分子量 → 半径 の変換が肝！ 蛋白質1個の質量 = 分子量／アボガドロ数 (NA) = 9000/NA (g)

31 単位(C) 移動度 単位(m) (d) 電荷価数: -5, 分子量: 9000の球状蛋白質 単位(g/mol = g•mol-1) 分子1 molの質量 分子量 ≠ 半径 ( r に分子量を代入してはダメ!) ただし、分子量と半径 r には一定の関係がある(関数関係) 分子量 → 半径 の変換が肝！ 蛋白質1個の質量 = 分子量／アボガドロ数 (NA) = 9000/NA (g) 蛋白質1個の体積 =蛋白質1個の質量／密度 (a (g/m3)) = {9000/NA (g)}/a (g/m3) 9000 = (m3) NA•a 4πr3 蛋白質1個の体積 = (m3) (球の体積の公式) 3

32 √ √ 単位(C) 移動度 単位(m) (d) 電荷価数: -5, 分子量: 9000の球状蛋白質
単位(g/mol = g•mol-1) 分子1 molの質量 9000 4πr3 蛋白質1個の体積 (m3) = = NA•a 3 4πr3 NA•a 9000 (球の体積の公式) = 3 3×9000 27000 r3 = = 4πNA•a 4πNA•a √ 3 27000 √ 3 1 r = = 30 4πNA•a 4πNA•a

33 √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ (d) 電荷価数: -5, 分子量: 9000の球状蛋白質 27000 1 r = = 30 (m)
4πNA•a 4πNA•a (e) 電荷価数: -4, 分子量: 12000の球状蛋白質 √ 3×分子量 √ 3×12000 √ 36000 √ 3 3 3 3 36 r = = = = 10 4πNA•a 4πNA•a 4πNA•a 4πNA•a (m) (f) 電荷価数: -6, 分子量: 15000の球状蛋白質 √ 3 3×分子量 √ √ √ 3 3×15000 3 45000 3 45 r = = = = 10 4πNA•a 4πNA•a 4πNA•a 4πNA•a (m)

34 √ √ √ (d) 電荷価数: -5, 分子量: 9000の球状蛋白質 Q μ(d) = 6πηr = 6πη r 1 5e 27000
4πNA•a √ 3 e 53×4πNA•a 54 πNA•a (e) 電荷価数: -4, 分子量: 12000の球状蛋白質 μ(e) = Q 6πη r 1 4e = 36000 4πNA•a √ 3 e 140.6 πNA•a (f) 電荷価数: -6, 分子量: 15000の球状蛋白質 μ(f) = Q 6πη r 1 6e = 45000 4πNA•a √ 3 e 52.08 πNA•a 答: (f) > (d) > (e)

35 分離分析：まとめ DNA塩基配列解析(シーケンシング) キャピラリーゲル電気泳動 どちらか不明 キャピラリーゾーン電気泳動
生命科学(ゲノム配列解析)を飛躍的に進めた装置