腎臓特異的タンパク質myo-イノシトールオキシゲナーゼ免疫測定法の開発、急性腎障害バイオマーカーの候補

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1 腎臓特異的タンパク質myo-イノシトールオキシゲナーゼ免疫測定法の開発、急性腎障害バイオマーカーの候補
J.P. Gaut, D.L. Crimmins, M.F. Ohlendorf, C.M. Lockwood, T. A. Griest, N.A. Brada, M. Hoshi, B. Sato, R.S. Hotchkiss, S. Jain, and J.H. Ladenson May 2014 © Copyright 2014 by the American Association for Clinical Chemistry

2 序論 急性腎障害 (AKI) は、一般的で重大な問題である 代表的な診断であるクレアチンや尿量は、特異性に乏しく感度が悪い
45%の重篤患者、20%の入院患者に見られ、罹患率・死亡率の上昇を引き起こす結果となる 軽度のAKIにおいても、慢性腎疾患のリスクを上昇させる 代表的な診断であるクレアチンや尿量は、特異性に乏しく感度が悪い 筋肉量、食事、肝機能に依存する 腎機能が50%低下するまで、変化しない場合がある

3 序論 早期の、かつ信頼性のあるAKIバイオマーカーが求められている
構造的なバイオマーカーは、障害後に上昇する Kidney injury molecule-1, neutrophil gelatinase associated lipocalin, interleukin-18, tissue inhibitor of metalloproteinase-2, insulin-like growth factor-binding protein-7 内因性の構造的なAKIバイオマーカー Alkaline phosphatase, a-glutathione-S-transferase, g-glutamyltranspeptidase, N-acetyl-b-glucosaminidase

4 疑問 理想的な腎障害バイオマーカーは何か？

5 材料と方法 腎臓特異的遺伝子の同定 抗myo-イノシトールオキシゲナーゼ (Anti-MIOX) 抗体
ジーンクリップアレイ (Affymetrix) 分析が、3匹のC57Bl/6マウスから採取された脳、肝臓、脾臓、腎臓、骨格筋、肺、膵臓、腎臓、小腸で行われた。 腎臓中で平均差分値が10,000以上、他の組織に比べて腎総で10倍以上の高発現、近位尿細管に発現している遺伝子が検索された。 抗myo-イノシトールオキシゲナーゼ (Anti-MIOX) 抗体 ヒト組換えGST-MIOXに対するウサギポリクローナル及びマウスモノクローナル抗体が作製された。 組換えMIOXは、N末端エドマン配列分析により確認された。

6 材料と方法 MIOX免疫測定 2種類のマウスモノクローナル抗体を用いた、電気化学発光検出システムによるMIOXサンドイッチ免疫測定法を開発した。 標準曲線作製には組換えヒトGST-MIOXを用いた。 動物モデル 8-12週齢のC57Bl/6マウスに、両側腎虚血術を30分間行った。 手術1週間前に血清を収集し-80°Cで凍結保存した。 2匹の偽手術動物に対しては、血管茎クランプ未施行以外は同一の手順を行った。 手術後24時間に血清及び腎臓を収集した。

7 材料と方法 ヒト患者 24-72時間で血漿クレアチンが上昇した成人重篤患者をスクリーニングした。
血漿クレアチンが72時間安定した患者もスクリーニングした。 慢性腎疾患や膀胱留置カテーテルを有さない患者は除外された。 クレアチニン上昇前 (time 0) 及びクレアチニン上昇後 (time 54) の残余血漿検体を収集した。 クレアチンの安定した代表的な患者の1検体を取得した。 患者の医療記録、基本情報、尿量、診断をレビューした。 乏尿は少なくとも6時間の尿量が、0.5 mL/kg/h未満で定義した。

8 疑問 バイオマーカー研究における残余サンプルを用いた利点と欠点は何か？

9 MIOXの腎臓特異性 Figure 1. (A) マウス組織中のMiox mRNA 発現。 (B) ヒト組織ホモジネート中のMIOX発現 (50 mg protein/lane)、ウサギ抗MIOXポリクローナル抗体による検出。観察されたタンパク質はカルボニックアンヒドラーゼ (CA, 29 kDa) とオボアルブミン (OVA, 45 kDa) の間に泳動される。 SBTI, 大豆トリプシンインヒビター (20 kDa)。一次抗体非存在下での染色は認められなかった。

10 抗MIOX抗体 Figure 2. (A)正常ヒト肝臓ホモジネート (kidney) のウサギ抗MIOXポリクローナル抗体 (pAb R9544) 及びマウスモノクローナル抗体12H06、1D10によるウェスタンブロット。GST-MIOXをトロンビンで切断、同一ゲルで泳動、PVDF へ転写し、タンパク染色を行った (Protein Stain) 。 タンパク染色されたバンドはエドマン配列分析され、MIOX及びGSTである事が確認された。3種類の抗体全てに反応した唯一のバンドは組換えMIOX (~33 kDa) と一致した。

11 マウスAKIモデル Figure 4. ベースライン及びAKI後24時間のマウス血清中のMioxを測定した (n=5)。血清Mioxは障害24時間後で上昇した(2.8 ± 0.7 ng/mL; mean ± SEM). *P<0.02 (paired t-test)。(B) 代表的な障害24時間後の腎皮質切片。広範囲な尿細管壊死が認められる (矢印、H&E, 400×)。偽手術マウスの尿細管に壊死は認められない

12 ヒト患者のMIOX Figure 5. 重篤及び入院患者のMIOX。 (A) 血漿クレアチニン (Cr) は先行測定値Cr (time 0) と比べて54.3±3.8時間 (time 54) でピーク を示し、AKI患者time 54で上昇した (**P < 0.005) 。 (B) AKI患者は非AKIに比べtime 0及びtime 54で高値の血漿MIOX濃度を示した (*P = 0.002) 。

13 ヒト患者のMIOX Figure 6. (A) 血漿クレアチンはtime 0において全ての群で同様な値である。 (B) 血漿MIOXはtime 0において乏尿及び透析の必要な患者で上昇した。 *P<0.05.

14 疑問 急性腎障害バイオマーカーとしてのMIOXの利点と欠点は何か？ MIOXの生物学に関して解答すべき追加の疑問は何か？

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