E. Coli Time Manager Since 2008

Presentation on theme: "E. Coli Time Manager Since 2008"— Presentation transcript:

1 E. Coli Time Manager Since 2008
iGEM Chiba 2009 E. Coli Time Manager Since 2008

2 ‘０９CHIBAは流れと精確性のある時間差スイッチをつくる！
他チーム周期時計 ・別々の入力であるため、 　同一系内での時間の流れを表現することができない。 ・１通りの時間差しか生み出せていない。 ・周期を系全体であわせるため、シンクロシステムを考える必要がある。 ・Paris/NYMU/Melbourne　どのiGEMチームもデバイスができていない。 シンクロシステムが必要ない’08Chibaタイマーの 計れる時間の種類・正確性を増すことができれば、周期時計を使わなくとも時間の流れを表現できる！

3 時限装置の集合で流れを作る 並列型 直列型 ここでもう１点問題になってくるのは、どのように時間の流れを作るかです。
私たちは、時間の流れを作る方法として「直列型」と「並列型」の２種類を考えました。 「直列型」では、スライド左側の図のようにある入力を受けた回路が新たなシグナルを出し、それを受け取った回路がまた次のシグナルを出すという行為を繰り返すことで時間の流れを作ろうという案です。 A→B→C→D→E この案の利点は一つの系で多種の出力ができる点です。 例えば一番左側の回路にはGFP、真ん中の回路にはRFP、右側の回路にはYFPを組み込んでおけば、１回入力するだけで３色の蛍光が観測できます。 一方この案の欠点は１つが駄目になるとそこから下流の回路が発現しない点です。 この案のシステムを考えれば明白なことですが、全ての回路は自身の１つ上流の回路の出力を自身の入力として起動するため、１つでも出力できない回路があるとそこから下流の回路は起動できなくなってしまいます。 「並列型」では、スライドの右側にあるように、全ての回路が同じ入力で起動し、それぞれが違う出力をすることで時間の流れを作ろうという案です。 A→B A→C A→D A→E この案の利点は、どこかの回路が駄目になっても「直列型」のように止まらず、最後までそれぞれの回路が発現できるという点です。 例えばスライド右側の図の真ん中の回路が止まってしまったとしても、他の回路は起動しておりそれぞれの出力をすることができます。 一方この案の欠点は順番通りに発現できない可能性があるという点です。 それぞれの回路が個別に起動するため、A、B、Cの順に発現させたいとき、AからBが発現する回路とAからCが発現する回路の順番が入れ替わってしまう可能性があります。

4 並列・直列の精確性面の特徴 並列型 直列型 ・順番を追い越す。 ・入力が全てのスイッチに入らなければ、全てのスイッチが動くということはない。
・初めの入力で全てのスイッチを起動することができれば、出力の時間間隔は一定の時間を保つ事ができる。 ・逆に初めの入力で全てのスイッチを起動できなかった場合、出力の時間感覚は一定の値を保つことができない。 ・順番を追い越さない ・１部分に入力が入ることで全てのスイッチが連動する。 ・全てのスイッチを初めに起動させる必要がないので、出力の時間間隔が、最初の入力によって左右されることがない。

5 Σ①！ ◎→ Σ②！ 並列型：LuxR Mutant ◎→ Σ①！ ◎→ Σ②！ pTet-LuxR pLux-GFP pLac-LuxI
◎→ Σ①！ ◎→ Σ②！ 並列型：LuxR Mutant Σ①！ ◎→ pTet-LuxR pLux-GFP Σ②！ pLac-LuxI pTet-LuxR pLux-GFP

6 並列型：Mutant parts 作成 ◎→ Σ①！ ◎→ Σ②！ ↑
◎→ Σ①！ ◎→ Σ②！ ↑ 並列型：Mutant parts 作成 Wild type よりも30分以上蛍光強度上昇の様子が早まったor遅れたモノだけ PCRでbiobrick仕様の制限酵素サイトをつけ、p15Aのプラスミドにのせる。 P15A LuxR mutant

7 ◎→ Σ①！→ Σ②！ 直列型：Lux-Lasカスケード ◎→Σ①！→Σ②！ pTet-LuxR pLux-LasI-RFP
pTet-LasR pLas-GFP pLac-LuxI

8 直列型：Las Check ◎→Σ①！→Σ ②！ ↑ 昨年度動作を確認していないLasのCheckをします。
Plac 　 LasI K : 注文中です 　 　　　　LasR 　　plas 　 GFP

9 直列型： パーツ作成実験 ◎→Σ①！→Σ②！ ◎ : LuxI(Sender) BBa_K084012 を使用。 plac LuxI
① : LuxR(Receiver ) + Reporter + LasI(Sender) 作成が必要。 ptet 　 LuxR plux 　　　GFP LasI ②: LasR(Receiver) + Reporter 作成が必要。 ptet 　 LasR 　　　plas 　 GFP LasI

10 直列型：パーツ① LuxR-pLux-RFP-LasI
◎→Σ①！→ Σ②！ ↑ 直列型：パーツ① LuxR-pLux-RFP-LasI 初号機 : LuxR(Receiver ) + Reporter + LasI(Sender) ptet 　 LuxR plux 　　　RFP LasI I : 注文中です ptet 　 LuxR 　 plux 　　RFP C0178 　LasI 1, T9002からPCRでターミネーターを取り除く。（Reverseプライマーデザイン必要） 2, C00178を作成して完成

11 直列型：パーツ② LasR-pLas-GFP
◎→Σ①！→Σ②！ ↑ 直列型：パーツ② LasR-pLas-GFP 弐号機 : LasR(Receiver) + Reporter ptet 　 LasR 　　　plas 　 GFP R0040 pTet K : 注文中です 　 LasR 　　　plas 　 GFP 1, R0040をつなげる。

12 ほしいデータ デモンストレーション 野澤＆山本がホワイトボードで説明します。

13 優先順位 1, LuxR Mutant 選別/データーとり 1, LasI-LasR稼働実験
3, MutantのBiobrick化/データとり 4, デモンストレーション用データとり 4, 直列型作成

14 各種〆切日 09/18 ・Jamboree attendance fee due ・Request for variance due
・Track selection due ・Project abstracts due ・Team rosters due 10/21 ・Project and part documentation due ・BioBrick Part DNA needs to be received ・Judging form due ・Wiki FREEZE

15 具体的なスケジュール 画面切り替えます