分析系応用実習 環境汚染物質の分析 061130.

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1 分析系応用実習 環境汚染物質の分析 061130

2 考える習慣を身につけよう

3 実習の内容 １） 実習講義・器具点検・試薬調製 ２） ①室内環境：ホルムアルデヒドの測定 ②水質試験法：溶存酸素 (DO)の測定
３） ①農薬をGCで検出・定量 ②室内環境：気温、気湿、カタ冷却力、気動、感覚温度 を算出、騒音、照度、炭酸ガスの測定 ４） 重金属の原子吸光光度法による検出・定量 ５） アオコの毒素microcystinのHPLC による検出・定量 ６） 今回の実験のまとめ・報告会、器具点検

4 HPLC使用の実習（アルデヒド）のおさらい
①は、ホルムアルデヒド ②は、アセトアルデヒドでした では・・・ 矢印で示されたピークって何？ 考え方・・・ 検出される化合物の共通点？ 検出波長？ 疎水性の大きさ？

5 アオコの異常発生 2005/8/2 長野県諏訪湖 Microcystis aeruginosa
この写真を見てわかるように池の水が緑色に染まっています。これは原核生物であるラン藻類が異常増殖した姿であり、一般的にアオコと呼ばれる現象です。 みなさんはアオコという言葉を一度は耳にしたことがあると思いますが、この大量発生により様々な問題が発生します。特に世界的に深刻な問題として、ここに出したMicrocystis aeruginosaを代表とする有毒ラン藻はMCと呼ばれる非常に強力な毒素を産生します。 2005/8/2　長野県諏訪湖

6 湖沼生態系の循環図 湖沼 生合成 N, P 毒性発現 人類 富栄養化 肝臓毒 カビ臭物質 （Microcystin類） アオコ発生 肝臓毒性
アオコの発生は人類の活動と大きく関係しています。 工場や一般家庭から排出される汚染された水が湖沼の富栄養化を引き起こし、気温の上がる夏になるとラン藻が異常発生します。 ラン藻の一部は次に詳しく説明しますがMCを生産します。このMCが人間の活動に影響を及ぼして問題となっています。 生合成 N, P 2-methylisoborneol geosmin 毒性発現 肝臓毒 カビ臭物質 肝臓毒性 発がんプロモーター作用 人類 （Microcystin類）

7 Microcystin 類の構造 実習書p45 参照 6. D-Glu (iso) 7. Mdha 1. D-Ala 5. Adda
ここに示したのがラン藻毒MCです。 7個のアミノ酸が環状のペプチドを形成しています。 MCには一部の構成アミノ酸が異なるものが存在し、R1R2で示した部分のアミノ酸の一文字略号をmicrocystinのあとにつけてR1がLeu,R2がArgならMCLRと命名されます。 3. D-b-Me-Asp (iso) Adda: (2S,3S,8S,9S)-3-amino-9-methoxy-2,6,8-trimethyl-10-phenyldeca-4(E),6(E)-dienoic acid D-β-Me-Asp: D-erythro-β-methylasparatic acid Mdha: N-methyldehydroalanine

8 Microcystin 類の物理化学的性質
親水性 疎水性 MCの物理化学的性質です。 MCはAddaが疎水性、その他の部分が親水性を示すため、有機溶媒と水系溶媒の両溶媒に溶けにくいという性質を持っています また、N,C末端を持たないため安定です。 ・Adda 部は疎水性、他の部位は親水性を示す ・有機溶媒と水系溶媒の両溶媒に溶けにくい ・光により幾何異性化や分解が起こり、毒性が軽減、消失する ・熱に安定。

9 Microcystinの生理活性 ・肝臓に特異的に蓄積 ・タンパク質脱リン酸化酵素 (PP) 1 およびPP2Aの阻害
・肝臓細胞のアポトーシス誘導 ・肝臓の出血 ・発がんプロモーター作用 Microcystinの生理活性ははっきり解明されていませんが、 肝臓への特異的な蓄積、PP阻害作用、肝臓の細胞死によって引き起こされる大量出血で最終的には死に至ります。 マウスを用いた実験では経口投与ではあまり毒性はないものの、経気管投与、腹腔内投与、静注での半数致死量は50-100μg／ｋｇとされています。 Microcystin-LRによるPP1の活性阻害 J. Goldberg et al. Nature, 376, 745 (1995)

10 Microcystin-LRの生理活性 腹腔内投与 皮下投与 LD50 75 mg/kg LD50 75 mg/kg 気管内投与 経口投与
肝臓への特異的な蓄積、PP阻害作用、肝臓の細胞死によって引き起こされる大量出血で最終的には死に至ります。 マウスを用いた実験では経口投与ではあまり毒性はないものの、経気管投与、腹腔内投与、静注での半数致死量は50-100μg／ｋｇとされています。 Microcystinの70種近い同族体のうち、Microcystin-LRの毒性が一番強い。 経口よりも、直接血液等に入る場合に、毒性が発現しやすい。 毒性は、フグ毒テトロドトキシンと同程度、青酸カリの数十倍程度。

11 Microcystin-LR, YR, RR の比較
疎水性の違いはどこからくるか？実習書p45参照 ODSシリカゲルカラムでの分離の説明です。 ODSの原理は先週のアルデヒドと同じなので省きます。 ここではmicrocystin類の中で比較的よく検出されるMCRR,YR,LRについて説明します。 この３つのMCはR2のアミノ酸はいずれもArgなのでR1以外は全く同一の構造です。ですからR1の疎水性の強さの順がMCの疎水性の順になります。 Leu, Tyr, Argを比較すると側鎖部分が炭素のみからなるLeuが最も疎水性が高く、フェノール性水酸基を持つTyrは少し疎水性が低く、グアニジル基を持つArgが最も疎水性が低いです。 R1 R2 L-Leu L-Tyr L-Arg L-Arg microcystin-LR microcystin-YR microcystin-RR

12 Microcystin類のODS シリカゲルカラム内の挙動
Time 移動相 MCLR この3つのMCはLRが最も疎水性が高く、次にYR,RRの順で、溶出順序はこの逆のRR,YR,LRの順になります。 MCLR ODS MCYR ODS ODS MCLR ODS MCYR MCRR 保持 MCRR MCYR MCLR 　　：疎水結合 溶出 溶出 溶出 microcystin（MC）の 疎水性： MCRR ＜ MCYR ＜ MCLR

13 Microcystin 類の検出 Adda 共役ジエン 238 nm MCの検出には238nmのUV吸収を使用します。 アルデヒドではDNPHの発色団を使用しましたが、MCの検出にはAddaの共役ジエンを使います。 この共役ジエンの吸収極大はしたの式のように予想することができ、実際の測定結果でこの値に近い238nmを示すことが明らかになっています。 　 Microcystin 類は 238 nm 付近に吸収極大をもつ。この吸収極大は Adda の構造中の共役ジエン（S-trans ジエン）に由来している。 吸光度 波長 (nm) Microcystin-LRのUVスペクトル 217 nm ＋15 nm ＋ 8 nm = 240 nm ジエン ジエンに結合する ３つのアルキル基 移動相の40 % メタノール

14 HPLC 装置 インジェクター ポンプ カラム 圧力計 MCLR 移動相 MCYR MCRR HPLC 条件
先ほどカラムの分離について説明したので次に検出器の説明をします。 圧力計 移動相 HPLC 条件 移動相：メタノール：0.05 Mリン酸緩衝液 （pH 3.0）＝6：4 検出器 カラム： STRODS-2（Shimadzu） 　　　　 (4.6×150 mm) 記録装置 流速：1 mL/min 廃液 注入量：20 mL 検出：UV 238 nm 最新機器分析学　南山堂

15 HPLC による microcystin-LR, RR, YR の分離
測定によってテキストにあるようにこのように検出されます （保持時間） 溶出順と疎水性の関係は？ 疎水性：microcystin-RR 　microcystin-YR 　 microcystin-LR 分析系応用実習テキスト p.46

16 ラン藻に含まれる microcystin の定量
本日配布資料参照 ・諏訪湖産ラン藻Suwako97 　およびSuwako99 乾燥藻体 （重量を記録） 抽出 ① 抽出液 では具体的な操作の説明に移ります。 先ほども言いましたが、まずラン藻乾燥藻体から抽出を行い、次にクリーンナップをします。 ② クリーンナップ 試験溶液 HPLC 検量線と照らし合わせ濃度を算出→このあと？ 今回、検量線作成のためのクロマトグラムは、実際に標準サンプルをHPLCに入れて、各班で作成します。

17 ① 抽出 20mLのシリンジ 遠心分離 上清液 撹拌 抽出ろ液
乾燥藻体 上清液 5 % 酢酸15mL 遠心分離 ①の抽出です。 配った乾燥藻体を全部一本の遠心管に入れ、そこに５％酢酸15mLを注ぎます。 ここに攪拌子を入れ、30分間攪拌して抽出します。抽出されたMCは酢酸水溶液に溶解しているので遠心分離で抽出されたカスの細胞を取り除き、 上清をフィルターでろ過します。 ここでは「20mL」のテルモシリンジを使ってください 脂溶性が高い物質（色素等）まで抽出してしまい、HPLC 分析やクリーンナップ等の操作が困難になる。そのため水系溶媒（酢酸水溶液）を用いて抽出する。 1300 × g （約 3000 rpm） 10分 ガラス繊維 フィルター 遠心管を使用（撹拌子を入れるのを忘れずに） 上清液 撹拌 抽出ろ液 （30分） 絶対に遠心管を振らない！ ・有機溶媒（アルコール等）を用いて抽出すると・・・？　なぜ酢酸で抽出してるの？ 分析系応用実習テキスト p.44

18 ② クリーンナップ（固相抽出） 10mL 抽出ろ液 溶出液（90％、100％メタノール画分のみ） 濃縮乾固（ロータリーエバポレーター）
あらかじめ ODS カートリッジには、メタノール→水（各5mLずつ）を 流しODS 基を活性化させておく、また操作中ODSカートリッジは、 乾燥させないよう、前の溶液をほんの少し残し、次の溶液を入れる 抽出ろ液 活性化に用いた廃液：マイヤー① ○抽出ろ液をODS カートリッジに通す 空気 ○水（5mL） 水画分廃液：マイヤー② ジョイント ○20 ％ メタノール（5mL） 20％メタノール画分廃液：マイヤー③ 抽出ができたら次にODSカートリッジでクリーンナップを行います。 ODSカートリッジはまず活性化を行う必要があります。 テキストの「装置および器具」の2行目に書いてありますが、まずメタノール5mL をカートリッジに通します。 カートリッジの上からジョイントをはめた「10mL」のシリンジで空気を押し込みその圧力で液体を落とします。 このとき注意するのがカートリッジ内ODS樹脂が必ず溶媒の液に浸っている状態にすることです。 メタノールを通したら次に水5mLを同様に通します。 次に先ほどのろ液を通します。この時点でMCはODS樹脂に保持されます。 次に水、20％メタノールを流して抽出ろ液中の疎水性の低い物質を洗い流します。 続いて90％メタノールと100％メタノールを流してMCを含む疎水性の高い物質を溶出し、ナスコルに回収します。 90％メタノールまでは先ほど言ったようにODS樹脂が必ず液に浸っている状態にして、最後の100％メタノールだけは最後まで出し切ってください 90％、100％の溶出液をエバポレーターで完全に乾燥させて、正確に　mLの40％メタノールで再溶解してください。 ろ過と希釈を行ってHPLC分析を行ってください。 各溶液 ○90 ％ メタノール(5mL) 試験溶液用すり付きナス型フラスコ（microcystin画分） ○メタノール（5mL） ODS カートリッジ 溶出液（90％、100％メタノール画分のみ） 濃縮乾固（ロータリーエバポレーター） 40 ％ メタノール（10mL）に再溶解 適宜希釈、ろ過（メンブレンフィルター） 溶出液 （マイヤー①～③、ナスコル） 試験溶液とし、HPLC 分析 分析系応用実習テキスト p.44

19 濃度算出 －検量線法－ microcystin 標準溶液 ピーク面積 検量線 ：0.4 mg/mL ：2.0 mg/mL ：試験溶液 0.4
（なぜ直線･･･？） ：試験溶液 濃度の求め方はアルデヒドと同じです。 まず検量線を作成して、次に試験溶液のピーク面積から濃度を計算してください。 もし検量線から外れてしまった場合は再度希釈して測定し直してください。 0.4 2.0 microcystin 濃度（mg/mL）

20 まとめ 乾燥藻体 抽出液 試験溶液 検量線と照らし合わせ濃度を算出 抽出 クリーンナップ HPLC
脂溶性が高い物質（色素等）を抽出しにくい。 ⇨クリーンナップの操作が容易になる。 ⇨ HPLC による定量が正確に行える。 抽出 （5％ 酢酸） 抽出液 今日の実験のポイントのまとめです。 まず乾燥藻体から酢酸抽出をします 次にODSカートリッジでクリーンナップを行い、疎水性の低い物質を除去します。 最後にHPLCで3種類のMC類を疎水性の違いを利用して分離、定量をし、検量線を使って濃度を算出します。 疎水性の低い物質（不純物）を除去。 ⇨ピークの明確化により、HPLC による定量を正確に行える。 クリーンナップ （ODS カートリッジ） 試験溶液 microcystin は種類により疎水性が異なる。 ⇨ ODS シリカゲルカラムを使った HPLC を用いて分離、定量ができる。 HPLC 検量線と照らし合わせ濃度を算出

21 実験スケジュール 撹拌抽出（30分間） HPLC分析：標準溶液の分析 （各班１台割り当て） 遠心分離（10分間）
　（各班１台割り当て） 質問があれば、待ち時間にODSカートリッジ 使用方法説明 遠心分離（10分間） 固相抽出（ODSカートリッジ）クリーンナップ エバポレーター → 再溶解 → メンブレンフィルター HPLC分析：抽出試料の分析

22 渡すもの（要返却） ・遠心沈澱管・ナス型フラスコ立て 4コ （特に汚れていなければそのまま返却） ・遠心沈澱管 50 mL 2コ
・遠心沈澱管・ナス型フラスコ立て 4コ 　（特に汚れていなければそのまま返却） ・遠心沈澱管 50 mL コ ・撹拌子 コ ・テルモシリンジ 10 mL（ODSカートリッジ加圧用） 2コ ・ODSカートリッジ用ジョイント（絶対に捨てないで） 2コ ・ナス型フラスコ 50 mL（すりのふた付き） 2コ ・ガラスシリンジ 2 mL（メンブレンフィルター用） 2コ ・ガラスシリンジ用針　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　2コ ・メスフラスコ 10 mL コ ・白蓋付きバイアル 2ml　　　　 2コ 　（以上９点は洗浄して返却）

23 渡すもの（廃棄） ・凍結乾燥した諏訪湖産ラン藻（Suwako97） 約100 mg
　（以上2点はキムワイプ・ろ紙等に吸わせてアオコ用ゴミ箱に廃　 　棄：試薬台４） ・テルモシリンジ 20 mL（ガラス繊維フィルター用） 2コ ・ガラス繊維フィルター 2コ ・ODSカートリッジ 2コ ・メンブレンフィルター 2コ 　（以上4点は医療用プラスチックとして廃棄：入り口横）

24 溶液および機器 使う溶液（ドラフト） 標準品（HPLC前） ・5%酢酸 ・MCRR, YR, LR混合溶液
・メタノール (2 mg/mL, 0.4 mg/mL) 調製する溶液 ・20％メタノール ・90％メタノール ・40％メタノール 使う機器 ・マグネチックスターラー ：12本同時（試薬台４） ・遠心沈殿管用天秤 ：2本同時（試薬台４ ） ・遠心分離機 ：4本用＋8本用（試薬台４ ） ・エバポレーター ：4つ同時（試薬台５ ） ・HPLC ：各班（実習室南側窓際）

25 廃液 Microcystin 含有溶液 Microcystin 含有廃液 （準備室前） Microcystin を含まない
（ナスコル・メスフラスコ・小バイアルのみ） Microcystin 含有廃液 （準備室前） Microcystin を含まない 有機溶媒含有溶液（マイヤー①③） 有機溶媒廃液びん （ドラフト南端） Microcystin ・有機溶媒 を含まない水溶液（マイヤー②） 流し（各実験台）

26 発表会について 日時：10月 22日（木） 13：10～ 場所：6号館4階 情報メディア教室
日時：10月　22日（木）　13：10～ 場所：6号館4階　情報メディア教室 10月 21日（水）　実習時間内に各班の担当項目を決定（各班2項目） 発表担当者は当日指名（各班のaから1人、ｂから1人） 発表方法：発表担当者は準備したスライド等を使用して発表を行う。 発表内容：実習テキスト（p.ⅲ）を参照。 発表時間：各項目10分程度、質問を含めて15分以内。 発表を担当しない班は3回以上質問をすること。

27 レポート・実習試験について レポート提出：10月28日（水）18：00 6号館1階薬学教育開発センター
レポート提出：10月28日（水）18：00　6号館1階薬学教育開発センター レポート返却：11月 4日（水）12：20～18：00　上記同じ場所 実習試験：11月7日（土）　15:00～　61（AB）、62（CD）教室 レポートの内容 ・目的 ・実験の流れ（フローシートで） ・検出のための原理 ・考察 一項目一枚に収めてください。 それぞれの実験の操作の意味や原理をしっかり考えて書いてください。

28 スライドショーの最後ですが、クリックしても終了しません