・Proof readingについて ・PrimerのTm値について

Presentation on theme: "・Proof readingについて ・PrimerのTm値について"— Presentation transcript:

1 ・Proof readingについて ・PrimerのTm値について
DNAの複製（replication ） ・Proof readingについて ・PrimerのTm値について

2 DNAの複製 この範囲を複製すると・・・ ５´ ３´ ３´ ５´ 複製フォーク ５´ ３´ ３´ ５´ 複製開始点

3 複製フォークの拡大 複製フォークの進行方向 RNAプライマー リーディング鎖 岡崎フラグメント ラギング鎖 RNAプライマー ３´ ５´
合成は連続的 ５´ 岡崎フラグメント ３´ ５´ ラギング鎖 ３´ ５´ 合成は不連続 RNAプライマー ３´ DNA合成が進んで先にあるRNAプライマーのところまでくると、RNAを分解しながら、合成は進み、さらにDNAのところまで到達するとリガーゼでつながる。 ５´

4 ５´ ３´ リーディング鎖 ラギング鎖がつながる

5 複製の正確さ DNAポリメラーゼには５´から３´へのポリメラーゼ活性（鋳型DNAに合う正しいヌクレオチドを選択し、取り込み、つなげて行く）のほかに、３´から５´へ向かうエキソヌクレアーゼ活性（付いたばかりのヌクレオチドが誤っていれば切り出して修正する）があります。この誤りを修正する機能を校正活性（Proof reading）といいます。 A T A ５´ ３´ ５´ ３´ ５´ T ポリメラーゼ活性 G G ５´ ５´ ３´ ３´ ５´ ５´ T T エキソヌクレアーゼ活性

6 ＞ ＜ どちらが誤り？ 不適正塩基修正酵素（mismatch correction enzyme） ポリメラーゼ活性 エキソヌクレアーゼ活性
正しいヌクレオチドが選択された時 ＞ ポリメラーゼ活性 ＜ エキソヌクレアーゼ活性 誤ったヌクレオチドが選択された時 不適正塩基修正酵素（mismatch correction enzyme） 新しくできたDNAのなかから、誤った塩基対を探し出し、誤った塩基を除去して正しい塩基に入れ替える酵素。 どちらが誤っているのか何故わかるのか？ どちらが誤り？ A G

7 1.鋳型鎖の近傍のメチル化されている塩基を見つけ、合成されたばかりで、まだメチル化されていない方の鎖の方を新生鎖と認識して新生鎖のヌクレオチドを除去して修正する。
2.新生鎖（ラギング鎖）には必ずニック（切れ目）があるので、それがあるほうを新生鎖として認識して修復する。 ミスマッチ ニック DNA誤対合修復タンパクが結合 新生鎖の方を除去 再び複製

8 Tm値を求める方法 Tm = I．最近接塩基対法(Nearest Neighbor method) 1000ΔH
log[Na+] Tm = -10.8+ΔS+Rｘln（Ct/4） ΔH：ハイブリッドにおける最近接エンタルピー変化の合計（kcal/mol） ΔS：ハイブリッドにおける最近接エントロピー変化の合計（cal/mol・k） R：気体定数（1.987cal/deg・mol） Ct：プライマーのtotalモル濃度[mol/l]　　 Na＋：Buffer中のNa+のモル濃度[mol/l]

9 最近接塩基対パラメータ Interaction ΔH[kcal/mol] ΔS[cal/mol・K] AA/TT -9.1 -24.0
Interaction ΔH[kcal/mol] ΔS[cal/mol・K] AA/TT -9.1 -24.0 AT/TA -8.6 -23.9 TA/AT -6.0 -16.9 CA/GT -5.8 -12.9 GT/CA -6.5 -17.3 CT/GA -7.8 -20.8 GA/CT -5.6 -13.5 CG/GC -11.9 -27.8 GC/CG -11.1 -26.7 GG/CC -11.0 -26.6

10 ※表の見方 Interactionは次のように表記しています 5'→3' 3'←5' Ａ Ｔ ／ Ｔ Ａ 例えば、AC(5'→3')のΔHは、GT/CAのΔH：－6.5[kcal/mol]となります
Ex) 計算方向 ５´末端 ３´末端 A　G　C　T　A　T　G　C AG GC CT TA AT TG GC -7.8 -11.1 -7.8 -6.0 -8.6 -5.8 -11.1 ΔH＝ ＝-58.2kcal/mol 同様にしてΔS＝-148.7cal/mol・k

11 Tm= Tm= = 2ｘ（A+T）+4ｘ（G+C） 9.83 1000x(-58.2) -273.15+16.6log(0.05)
-6 In{(0.5x10 )/4} = 例として、Ct：プライマーのモル濃度を0.5μM、Naイオンのモル濃度を50ｍMとして計算 9.83 II ．Wallace法 Tm= 2ｘ（A+T）+4ｘ（G+C） A、T、G、C：各ヌクレオチドがプライマー中に含まれる数

12 CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT
III．GC%法 Tm = log[Na+] + 41( XG + XC ) - 500/L XG,XC：プライマー中のGおよびCのモル分率 L：二本鎖を形成する部分のオリゴヌクレオチドの長さ（mer） Ex)以下の塩基配列のプライマーを用いて各計算式で計算してみますと・・・ 24mer ５´ ３´ CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT 便宜上すべて[Na+]=50×10-3、プライマー濃度Ct＝0.5×10-6で計算します。

13 Tm= = Tm= 2ｘ（7+4）+4ｘ（7+6） = I．最近接塩基対法(Nearest Neighbor method)
ΔH=－192.7[kcal/mol] ΔS=－481.4[cal/mol･K] 1000x（-192.7） -3 log(50x ) Tm= -6 ln{(0.5x )/4} = 73.2℃ II ．Wallace法 Tm= 2ｘ（7+4）+4ｘ（7+6） = 74℃

14 Tm= = III．GC%法 81.5+16.6log(50x10-3) + 41(7/24+6/24) - 500/24 61.3℃
それぞれの計算方法の違いにより、Na+濃度等を統一してもTm値は異なります。特に　10mer以下の短鎖、50～60mer以上の長鎖、GC%が大きく偏る配列においては　この差が顕著になります。 参考文献等 分子生物学講義中継part 1（羊土社） GENOMES second edition（MEDSI）