ゲル内タンパクの染色 ～銀染色～ ゲル内タンパクの染色で、主に行っている銀染色について勉強しました。

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1 ゲル内タンパクの染色 ～銀染色～ ゲル内タンパクの染色で、主に行っている銀染色について勉強しました。

2 原理 　　銀イオンはアンモニア性溶液中で銀ジアミン錯体を形成する。銀イオンや銀ジアミン錯体イオンはタンパク質と結合(-SH基に最も結合しやすい)し、これをクエン酸、ホルマリンの作用により還元して金属銀を析出し、ゲル内タンパク質の黒化像を得る。 銀イオンはアンモニア性溶液中で銀ジアミンさくたいを形成します。 銀イオンや銀ジアミンさくたいイオンはタンパク質と結合、（チオール基に最も結合しやすいです）し、これをクエン酸、ホルマリンの作用によって還元して金属銀を析出して、ゲル内タンパク質の黒化像を得る方法です。 チオール基＝側鎖 [Ag２(NH3)2]+ 銀ジアミンイオン

3 銀染色を用いる利点・欠点 ○ 好感度である 特殊な装置は不要である ゲルを乾燥保存できる × 定量性がない 非特異的である
○　好感度である 　　 特殊な装置は不要である 　　　ゲルを乾燥保存できる ×　定量性がない 　　 非特異的である 　　 廃液中の銀イオンを処理する必要がある 銀染色を用いる利点と欠点についてです 利点として、好感度であること、特殊な装置は不要であること、ゲルを乾燥保存出来ることなどがあげられます。 欠点は、定量性がないこと、非特異的であること、廃液中の銀イオンを処理する必要があることです。 銀イオンの処理については後で触れます。

4 他染色との比較 感度：＜1ng 定量性：× 検出方法：可視 蛍光染色 感度：＜0．5ng 定量性：◎ 検出方法：蛍光イメージャーが必要
銀染色 感度：＜1ng 定量性：× 検出方法：可視 蛍光染色 感度：＜0．5ng 定量性：◎ 検出方法：蛍光イメージャーが必要 CBB染色 感度：50～100ng 定量性：○ 銀染色と他の染色とを比較してみました。 主な染色法として他にあげられるのが蛍光染色とCBB（）染色です。 感度は銀染色と蛍光染色がCBB染色に比べて５０～１００倍以上よくなっています。 先ほども述べたように銀染色は定量性に欠けます。 そして、蛍光染色は検出に特殊な機械、蛍光イメージャーなどが必要となります。

5 染色結果の比較 CBB染色 銀染色 蛍光染色 染色結果を比較するとこのような感じになります。（HPから持ってきました）
銀染色はタンパクが茶色っぽく染まります（この写真では黒に近いですが、実際はほぼ茶色です） CBB染色は、色素をタンパクに結合させているのでこのように色がついて染色されます。 蛍光染色は蛍光イメージャーや励起光源を用いて、このように観察できます。

6 試薬（２D-銀染色試薬Ⅱ-第一） ①固定化剤 チオ尿素 ②前処理剤 ジチオスライトール、グルタルアルデヒド、チオ尿素 ③染色液A 硝酸銀
①固定化剤　チオ尿素 ②前処理剤　ジチオスライトール、グルタルアルデヒド、チオ尿素 ③染色液A　硝酸銀 ④染色液B　水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム ⑤現像原液　クエン酸、ホルムアルデヒド、チオ硫酸ナトリウム ⑥停止液　クエン酸 普段使っている２D－銀染色試薬Ⅱ第一に含まれている試薬です。 固定化剤にはチオ尿素、前処理剤には～

7 手順 ①固定液Ⅰ（10分）：メタノールと酢酸 ②固定液Ⅱ（15分） ③前処理液（10分）：グルタールアルデヒドなどによる増感 ④洗浄（5分）
⑤銀染色液（15分）：銀ジアミン錯体などがタンパクと結合 ⑥洗浄（2分×3回）：余分な銀ジアミン錯体などを洗浄 ⑦現像液（5～10分）：ホルマリンの作用で銀を析出 ⑧停止液：酸性にする ※全ての工程は振蕩しながら行う。 ※ケラチンの混入を防ぐため手袋をして操作する。 このような順序で染色します。 固定液Ⅰはキットの試薬ではなく、メタノールと酢酸と精製水を混ぜたものを使用します。 固定液Ⅱからはさきほどの試薬で述べたキットを用います。 固定液は、分離成分をゲルに固定し、且つ銀染色に不要な成分を除去します。 前処理液は、グルタールアルデヒドなどでタンパクを修飾し、増感するものです。 ここの洗浄は、ゲル内やゲル表面の不要な成分を洗浄除去します。 この際､『精製水』が清浄でなかったり、洗浄不十分であると､電気泳動像の汚れになります。 銀染色液で銀ジアミン錯体などがタンパクと結合されます。 ここの洗浄は、余分な銀ジアミン錯体などを除去するもので、ここでしっかり洗浄しないと銀が残って銀鏡反応が起きてしまったり、洗浄しすぎても必要な銀イオンまで流してしまうので、染色工程のなかでもとても大事なところだと思います。 現像液のクエン酸とホルマリンで還元して銀を析出します。 そして停止液を加えて、クエン酸で酸性にすることで反応を止めます。 全ての工程はしんとうしながら行います。 ケラチンが入らないように手袋をして操作します。

8 染色結果（２D-PAGE） タンパクがスポットとして染色されている
（二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動）では、このような染色結果になります。 タンパクがスポットとして染色されています。 これはゲルをコンピューターに取り込んだ画像なのでスポットが黒っぽく見えますが、実際は茶色いスポットです。

9 質量分析機 前処理剤（増感剤）に含まれるグルタールアルデヒドのアミノ基 を架橋する特性により質量分析前のゲル内消化の効率が悪く、
質量分析には向かない。 グルタールアルデヒドを用いていない試薬、キットを用いて染 色すると、質量分析が可能になる。 電気泳動で得たタンパクを質量分析器にかける場合、前処理液にグルタールアルデヒドが含まれているものは使えません。 グルタールアルデヒドはアミノ基を架橋する特性があるので、質量分析前のゲル内消化の効率が悪くなるからです。 よって質量分析器にかける場合は、グルタールアルデヒドを用いていない試薬、キットを用いて染色すると質量分析が可能になります。

10 銀染色液の処理 使い終わった銀染色液は、操作完了後直ちに塩酸や塩化ナト リウムを加えて塩化銀の沈殿物にして処理します。
そのまま放置すると爆発性の銀アミドを生成する危険がありま す。 銀染色の場合、染色液を処理しなければなりません。 使い終わった銀染色液は、直ちに塩酸や塩化ナトリウムを加えて塩化銀の沈殿物にして処理します。 そのまま放置すると爆発性の銀アミドを生成する危険があります。 （実験室では、廃液溜めに（　　　　　　　　　）を入れてあり、そこに染色液を捨てる方法を取っています。）