化膿レンサ球菌 L 型菌 124 L 株の ストレプトリジン O と ストレプトキナーゼの非産生について －川崎病との関連を考える－ 1

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1 化膿レンサ球菌 L 型菌 124 L 株の ストレプトリジン O と ストレプトキナーゼの非産生について －川崎病との関連を考える－ 1
ということを　報告し、 川崎病の溶連菌原因説との関連を考察したいと思います。 ご専門の諸先生方に、、ご指摘、ご教示いただけますれば、幸いです 1

2 化膿レンサ球菌の野生型と L 型菌 野生型 L 型菌 (１２４ L株） ２μｍ
野生型の菌に対しまして、 このように 近ずいて見ないと、何にも見えないほど ばらばらの、小さい粒子になっています。 この１２４L株は、江田先生らによって、１９７２年に、臨床分離株の溶連菌より、作成されたL型菌で、長期間、継代され、安定型のL型菌になっています。 L 型菌１２４ L 株の由来：　８２の臨床分離株より１３株のL型菌株が作 成され、本 L 型菌株のみ継代に成功　（横浜市大・江田ら､１９７２年） 安定型 L 型菌

3 化膿レンサ球菌の L 型菌１２４ L 株 0.05 μｍ～数μｍの菌体が見られる 1μｍ 走査電顕で見た、124Ｌ株の像です。
このように、１００ナノメーター以下のサイズから、数ミクロンのサイズまで 極端に異なるサイズの細胞が混ざっています。 1μｍ 0.05 μｍ～数μｍの菌体が見られる

4 ヒト赤血球に対する溶血反応（嫌気培養と好気培養）
実験方法　　 化膿レンサ球菌 L 型菌１２４ L 株の ストレプトリジンO 産生の確認 ヒト赤血球に対する溶血反応（嫌気培養と好気培養） 本株は通常の血液寒天培地では増殖しない 液体培地で増殖させ、溶血の有無を観察する まず、このＬ型菌のストレプトリジン０の産生を確かめるため、 血液寒天培地で、溶血を見る実験をいたしました。 このL型菌株は、市販の血液寒天培地には、生えてきませんので、 この様に まず、容器内に斜面培地のような血液寒天培地を作り、 ここに、L型菌用の液体培地を入れて、 ここで、L型菌を培養し、 この部分の溶血反応を見て見ることにしました。 嫌気培養を行って、SLOの産生を見ています。 血液寒天培地 L型菌用液体培地

5 １２４L 株には溶血帯が見られなかった 野 生 型 L 型 菌 Control K5866 K6169 124 L 結果 （嫌気培養）
　結果　（嫌気培養）　　　　　　　　 野　生　型 L　 型　菌 Control K5866 K6169 124 L その結果です。 このように 野生型の　この２株では、培養液が接した部分に このような、溶血帯が観察されました。 一方、菌を接種していない、このコントロールと　124Ｌ　L型菌のこの株では 溶血帯が見られませんでした この培養した液体培地を回収して遠心して見ますと、 １２４L 株には溶血帯が見られなかった　　　　　　　　　

6 124 L株の増殖を確認、溶血による培地の赤変がなかった
結果　　回収された菌体と培養液 K5866 K6169 124 L 菌体 培養液 野　生　型 L 型菌 このように、 L型菌も増殖しているのが確認されます。 L型菌の場合は、どうしても、菌体の収量は　野生型に比べて、少なくなります 上清の培養液を見ますと、 こちら、野生型が、溶血によって、赤くなっているのに比べて、 L型菌の方は、元の培地と変わらない色をしていまして、 このことからも、溶血が起こっていないことが、示されています。 124 L株の増殖を確認、溶血による培地の赤変がなかった

7 結果 化膿レンサ球菌L型菌１２４L株のストレプトリジンO産生に関するウエスタンブロッティング解析
Anti-streptolysin O mouse monoclonal antibody　(1：250希釈） ９４K・ ６７K・ SDS-PAGE 　　K6169 124 L 　　K6169 ９４K・ ６７K・ ウエスタン・ブロッティング 124 L K6169株 ドット・ブロッティング 124 L 次に、 L型菌の菌体成分中に SLO　蛋白があるか、という事を確かめるため、 嫌気培養した、菌体をソニケーションで破砕し、全菌体成分中にある SLO蛋白を抗SLO抗体を用いて、ウエスタンブロティングを 行いました。 こちらが、SDS-PAGEを転写して、ポンソー液で染めたものです。 コントロールとして、この野生型を、用いました。 こちらが、ウエスタンブロッティングの結果が、 野生型では抗ＳＬＯ抗体に反応した６９Ｋの バンドが確認されますが このＬ型菌株では、バンドが確認されませんでした。 こちらの、ドットブロッティングでも、このＬ型菌株では反応が見られず、 この124Ｌ株ではＳＬＯが産生されていなものと思われました。 １２４L株には抗ＳＬＯ抗体に反応するバンド、ドットが見られなかった

8 結果 化膿レンサ球菌 L 型菌１２４ L 株のストレプトキナーゼ産生に関するドットブロティング解析
Anti-streptokinase rabbit polyclonal antibody　(1：12000希釈） K5866 株 　 　　K6169 株　　 124 L 株 野　生　型 L　型　菌 次に、 ストレプトキナーゼを見てみました。 この抗体では、ウエスタンブロッティングがあまり、うまくいきませんでしたが、 ドットブロッティングでは、このように、 こちらの　野生型に比べて、 　Ｌ型菌株では、抗体への反応が見られませんでした。 これらの結果から、 このＬ型菌124Ｌ株ではＳＬＯ・ＳＫ　ともに産生されていなものと思われました。 １２４L株には抗ＳＫ抗体に反応するドットが見られなかった

9 ま と め １．化膿レンサ球菌 L 型菌１２４ L 株ではストレプトリジン O とストレプトキナーゼの産生が見られなかった。
ま　と　め １．化膿レンサ球菌 L 型菌１２４ L 株ではストレプトリジン O とストレプトキナーゼの産生が見られなかった。 ２．化膿レンサ球菌が L 型菌化すると、これらの酵素を産生しない株が生体内でも出現する可能性が示唆された。 ３．川崎病の溶連菌原因説との関連： 　以上、まとめますと、 この、化膿レンサ球菌のＬ型菌､124Ｌ株では ストレプトリジン0とストレプトキナーゼが産生されていないものと 考えられました。 このように、化膿レンサ球菌がＬ型菌化すると　これらの酵素を産生しない株が、生体内でも出現する可能性があるのではないかと考えられます。 このようなことから、 川崎病の溶連菌原因説との関連を考えて見ますと、 スライドチエンジ 9

10 川崎病 化膿レンサ球菌が疑われる点 化膿レンサ球菌が否定される点 １．猩紅熱と似た症状を呈する
２．患者の急性期血液中に、溶連菌外毒素(SpeA SpeC)とその抗体 　　があり、溶連菌ペプチドグリカンに対する抗体価も上昇する。 化膿レンサ球菌が否定される点 １．患者の血液培養で、溶連菌も、そのL型菌も分離されない ２．川崎病患者回復期血中のASLO値、ASK値が上昇しない ３．ペニシリン系の抗生剤が無効 川崎病は当初から、溶連菌が疑われていて、 その主な要因として、 このような、事があげられています。 一方、 それが否定される要因としては、 菌が患者から分離されない、Ｌ型菌も１６検体ほど調べた結果はネガティブであったということが報告されています。 また、アスロ値やＡＳＫ値が上昇しない、 ペニシリンが効かない、 といった点などがあげられています。 今回の結果から、 １２４Ｌ株のようなＬ型菌であれば、 この２と３が消せますので、

11 L型菌が疑われる点 １．グラム陰性菌様、リケッチア様、 Ｌ型菌様、と形容され る微小粒子が、患者の急性期血液、発疹部の皮下組織
１．グラム陰性菌様、リケッチア様、　Ｌ型菌様、と形容され 　る微小粒子が、患者の急性期血液、発疹部の皮下組織 　冠状動脈瘤部､心筋炎部などに観察（電子顕微鏡）さ 　れており、Ｌ型菌に類似している。 ２．ペニシリンが無効である。 墓に、Ｌ型菌が疑われる 点を探って見ますと、 患者の検体から、Ｌ型菌に良く似た形態の、非常に小さい粒子が 観察されています。

12 川崎病患者から検出された細菌様微小粒子 川崎病 Caterら､１９７５ 川崎病 Uenoら､１９８３ 川崎病 Uenoら､１９８３
川崎病　濱島ら、１９８５ このような電顕写真が報告されていますが、 いずれも、硬い細胞壁のような構造はみられず、 そして、粒子のサイズが一定していない、 かなり、小さい粒子も見られる、といった点がＬ型菌に、にていいるところです

13 川崎病 （Uenoら １９８３） L型菌１２４L株 （江田ら、１９７９） １μｍ １μｍ
川崎病　 （Uenoら　１９８３） L型菌１２４L株 　（江田ら、１９７９） こちらは、江田先生らが報告した、Ｌ型菌の１２４Ｌ株で。 こちらは、川崎病患者の血漿中に見られた、粒子です、 この論文では、こちらは血小板と解釈されて、この粒子が Ｌ型菌様の粒子となっていますが、 このように、細胞に中に、娘細胞ができるのもＬ型菌の特徴ですから、 これもＬ型菌ではないかを私はおもいますが、 いずれにしても、この形態は似ております。 １μｍ １μｍ

14 ストレプトリジン O ・ストレプトキナーゼ非産生株が 出現する場合がある。
　　L 型菌は通常の菌に比べ分離培養が困難である。 　　化膿レンサ球菌が L 型菌化すると、 　　ストレプトリジン O ・ストレプトキナーゼ非産生株が 　　出現する場合がある。 　　川崎病の病原体として化膿レンサ球菌の L 型菌を 　　更に検証する必要があると思われた。 　このようなことから もういちど、溶連菌原因説をＬ型菌という観点から、 検討する必要があるのではないかと考えています。 以上です。 スライドチエンジ 14