araC_lacI oscillator 1-1. promotor- RBS-adaptor-teminatorをPCRで増やす

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1 araC_lacI oscillator 1-1. promotor- RBS-adaptor-teminatorをPCRで増やす
-2. GFP、lacI、araCのパーツをPCRで増やす 2. promotor+RBS+adaptor+teminatorをプラスミドの中に入れる 3. araC、GFP、lacIのORFをHindIIIで入れる 4. araCとGFPをつなぐ 5. araC_GFP、lacIを同時に大腸菌に入れる

2 Step1-1. promotor- RBS-adaptor-teminatorをPCRで増やす
方法: PCRで増やす Adaprtorの部位は backboneに切れる 場所がない酵素を選ぶ (検討中) 必要なもの: *注文したprimer *P1.1H Primerとして注文 P1.1H Adaptor(パーツ以外の制限酵素部位、HindIII) B0010 EcoRI XbaI B0012 speI pstI 5’ ParaC/lacI RBS 3’ HindIIIはpromotorに切れる場所があるので、直す

3 Primer 5’側 3’ 5’ ParaC/lacI RBS 配列 5’ GAATTC CTTAAG TCTAGA AGATCT
Adaptor(パーツ以外の制限酵素部位、HindIII) EcoRI XbaI 3’ 5’ ParaC/lacI RBS Terminatorの最初の部分 配列 5’ GAATTC CTTAAG TCTAGA AGATCT catagcatttttatccataagattagcggatcctaagcaatacaattgtgagcgctcacaattatgatagattcaattgtgagcggataacaatttcaca BBa_B0010 attaaagaggagaaa AAGCTT TTCGAA ccaggcatcaaataaaacg 3’

4 Primer注文 3’側 5’ 3’ 配列 gggcctttctgcgtttata のantisense BBa_B0012 GAATTC
speI pstI Teminatorの最後の部分 5’ 3’ 配列 gggcctttctgcgtttata のantisense BBa_B0012 GAATTC CTTAAG TCTAGA AGATCT

5 Step1-2. GFP、lacI、araCのパーツをPCRで増やす
方法: PCRで増やす 必要なもの: *注文したprimer *パーツ #GFP(P1.2B) #lacI(P1.7L、P1.2Oのどちらか) #araC(P1.14L) HindIII HindIII 5’ パーツのORF ssrA tag 3’

6 Atggtgaatgtgaaaccagtaacg 3’ lacI
primer 5’側 HindIII 5’ ORFの最初の部分 3’ 配列 5’ P1.2B Atggtgagcaagggcgagg AAGCTT TTCGAA 3’ GFP P1.2O/7L 5’ AAGCTT TTCGAA Atggtgaatgtgaaaccagtaacg 3’ lacI P1.14L 5’ Atggctgaagcgcaaaatgatcc 3’ AAGCTT TTCGAA araC

7 Ggatgaactatacaaataataaのantisense GFP 3’ 5’
Primer(続き) 3’側 HindIII 5’ ORFの最後の部分 ssrA tag 3’ 配列 P1.2B Ggatgaactatacaaataataaのantisense AAGCTT TTCGAA GFP 3’ 5’ Acgcgtgcaaacgacgaaaactacgctttagcagcttaacgcgtのantisense P1.2O/7L Gctggcacgacaggtttcc のantisense AAGCTT TTCGAA lacI 同上(ssrA tagのantisense) 3’ 5’ P1.14L Gccgtcaagttgtcagctのantisense 同上(ssrA tagのantisense) araC 3’ AAGCTT TTCGAA 5’

8 Step2. promotor+RBS+adaptor+teminatorをプラスミドの中に入れる
必要なもの: Plasmid backbone *ColEI(P1.3D) *p15A(P1.9CとP1.9G、同じものだけどQualityに不安があるのでどちらもやる) 方法: パーツの制限酵素で切って貼る。 ぷちっ☆

9 Step3. araC、GFP、lacIのORFをHindIIIで入れる
araCとGFPはColEI、 lacIはp15Aに入れます。 間違わないように！！ よいしょ☆

10 Step4. araCとGFPをつなぐ araCとGFPをつないで、１つのプラスミドに入れる

11 Step5. araC_GFP、lacIを同時に大腸菌に入れる
うまくいけば振動する。。。