テーマ２ 摘出モルモット回腸 に対する薬物の作用 薬理学実習発表会 テーマ２ 摘出モルモット回腸 に対する薬物の作用

理論編 メンバー ３０１５ 大野 澄美玲 ３０１６ 大家 理伸 ３０２４ 海田 美幸 ３０３８ 小谷 有希子 ３０１５　大野　澄美玲　　３０１６　大家　理伸 ３０２４　海田　美幸　　　　３０３８　小谷　有希子 ３０４２　左近　郁絵　　　　３０４８　杉本　倫子 ３０５１　瀬川　朋未　　　　３０６８　永井　涼子 ３０７０　中山　知倫　　　　３０８７　松尾　悠紀 ３１００　山本　真　　　　　３１０３　米倉　伸彦

解剖·おさらい

腸神経系 Enteric Nervous System 外来神経系　 　・交感神経系 　・副交感神経系 壁内神経系 ・アウエルバッハ神経叢（筋層間神経叢）　　　　　　　 　　　　…腸管の運動を制御 ・マイスナー神経叢（粘膜下神経叢） 　　 　 …分泌や吸収などの粘膜機能 　平滑筋の直接的神経支配と壁内神経叢のニューロンへのシナプスを介した支配とがある

アセチルコリンについて ～生理機序～

Achの生合成 Ach生合成の律速段階 ＊コリンの取り込み Na+ 共輸送 Cell 外 Cell 内 コリン輸送体 へミコリニウムで抑制

Achの生合成 CH3 CH3 N+ CH2CH2OH Choline アセチルコリン エステラーゼ コリンアセチル トランスフェラーゼ CH3 N+ CH2CH2OCCH3 CH3 O Acetylcholine CH3 C S CoA O HS CoA CH3COOH Acetic acid コリンアセチル　　トランスフェラーゼ アセチルコリン　　　エステラーゼ Achの生合成

Achの貯蔵 ATP, プロテオグリカン含む 逆輸送 H+ 成熟した小胞体

ＡＣｈの遊離 量子的遊離のvesicle説 ＋ ・ACｈ遊離は数千分子のACｈが一つの量子として遊離の最小単位となり、非連続的な遊離が行われるという量子的遊離の性質を持っている。 量子的遊離のvesicle説 神経終末にシナプス小胞が存在し、その内に数千～数万分子のACｈを含むという事実 ACｈが量子的遊離を起こすという事実 遊離されるACｈはシナプス小胞内のものである ＋ つまり、神経興奮により終末内に流入したCa２＋が、シナプス小胞と細胞膜を融合させ、小胞内のACｈを細胞外へ遊離する(exocytosis)と考えられる。

ＡＣｈの遊離（静止状態） 神経が静止状態にある時も１～数個のシナプス小胞から自発的にACｈが遊離される。 Ach このACｈがACｈR内のNa＋チャネルを開口して終板に微小な脱分極を起こさせている。 Na＋ AChR こうして起こる脱分極を微小終板電位（MEPP)と呼ぶ。

AChの遊離（神経興奮時） Ｃａ２＋ Ach Na＋ Na＋ AChR 神経終末に活動電位が到達すると膜のCa２＋チャネルが開口し、Ca２＋が流入する。 神経終末でのCa２＋増加が引き金となり数百の量子が同時に遊離され、ACｈR内のNa＋チャネルが開き、 Na＋が流入し、MEPPの相加によって終板電位（EPP)を発生させる。終板電位により、電位依存性Na＋チャネル付近の電位が閾値に達するとNa＋チャネルのゲートが開き、自己再生的に活動電位となる。 Ｃａ２＋ Ach 電位依存性Ca２＋チャネル Na＋ Na＋ 電位依存性Na＋チャネル AChR

ACｈの生成・貯蔵・遊離・分解・フィードバック阻害 Mit アセチル－CoA ＋ コリン フィードバック阻害 酢酸 Ｃａ２＋ M ACh 電位依存性Ca２＋チャネル AChE 分解 N M AChE N N:ニコチン受容体 M:ムスカリン受容体

アセチルコリン受容体 ①ニコチン受容体 サブタイプ 局在 反応 アンタゴニスト チャネル遮断薬 筋肉型（NM) 受容体 神経筋接合部 αブンガロトキシン デカメトニウム ガラミン 神経型（NN) 自律神経節 中枢神経 神経ブンガロトキシン ネオスルガトキシン ヘキサメトニウム メカミラミン

②ムスカリン受容体 サブタイプ 局在 反応 アゴニスト 特異的アンタゴニスト M1 中枢神経 神経節 ピロカルピン ピレンゼピン テレンゼピン M2 心臓ペースメーカー ベタネコール メトクラミン ビンバシン ガラミン 心筋 M3 心臓以外の副交感神経効果器官 ヘキサヒドロシラジフェニドール

アセチルコリンについて ～平滑筋への作用～ アセチルコリンについて ～平滑筋への作用～

② ① 自律神経系 交感神経系 副交感神経系 ACｈ ACｈ NE ACｈ 節前神経 神経伝達物質 ニコチン 受容体 ニコチン 受容体 節後神経 NE ACｈ ① ② アドレナリン 受容体 ムスカリン 受容体

NE アドレナリン受容体 細胞膜 β2 Gs AC 促進 ATP cAMP↑ ①PKAの活性化 ②ミオシン軽鎖の 　リン酸化を抑制 筋弛緩

ムスカリン受容体 IP3 ACh 細胞膜 M2 M3 Gi Gq cAMP ↓ PLC 促進 DG PKA ↓ ① PLC 促進 筋小胞体 細胞膜　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 M2 M3 Gi Gq cAMP ↓ PLC　促進 DG PKA ↓ ① IP3 PLC　促進 筋小胞体 PIP2 Ca2+↑＋CAM　Complex カルモジュリン依存ミオシン軽鎖キナーゼ　活性 ミオシン軽鎖　リン酸化 ② ATPase　活性化 筋収縮

ヒスタミンについて

抗原 PIP2 DG PLC IP4 IP3 PKC ER [Ca2+] Ca2+ CaMK リン酸化 ヒスタミン 細胞骨格 蛋白 Lyn Ｓｙｋ DG PLC IP4 IP3 PKC ER [Ca2+] Ca2+ CaMK 細胞骨格 蛋白 リン酸化 ヒスタミン

ヒスタミン受容体のサブタイプ

IP3 H1 R O 細胞膜 C Gq PLC 促進 DG PIP2 筋小胞体 Ca2+↑＋CAM Complex MLCK活性 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　細胞膜 Gq PLC　促進 DG IP3 Ca2+↑＋CAM　Complex MLCK活性 ミオシン軽鎖　リン酸化 筋収縮 筋小胞体 PIP2 ATPase　活性

DMPPについて

DMPP ＊ジメチルフェニルピペラジニウム ＊ニコチン性アセチルコリン受容体のアゴニスト ＊自律神経節興奮薬 ＊初期脱分極を起こす ＊一部はムスカリン様作用を示す

化学式 CH 3 + N N N N CH 3 CH 3 ニコチン DMPP

まとめ

（receptor operated Ca²+ channel) ・細胞内Ca²+ストアから M2 M3、H1 R O C 　　　Ca２＋ 　　　ポ 　　　ン　 　　　プ 細胞膜　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 Gi Gq cAMP ↓ PLC　促進 DG PKA ↓ IP3 筋小胞体 PLC　促進 Ｒ Ｒ 筋小胞体 PIP2 Ca2+↑＋CAM　Complex 　Ca²+供給源： ・細胞外から　ROC 　（receptor operated Ca²+ channel) ・細胞内Ca²+ストアから MLCK活性 ミオシン軽鎖　リン酸化 IICR(IP3誘起性Ca²+放出） IP3R CICR(Ca²+誘起性Ca²+放出）RyR ATPase　活性 筋収縮

２＋ Ca -CaM ４ ２＋ + 4Ca　+CaM MLCK(不活化) ２＋ Ca –CaM・MLCK(活性化) ４

結果

略語 　　ACh（Acetylcholine) 　　His(Histamine) DMPP (Dimethylphenylpiperazinium) 　　C６ (Hexamethonium) 　　Atr(Atropine) DPH (Diphenhydramine)

方法 ①アゴニストを投与し収縮高を測定する ②３回洗浄、５分後１回洗浄、さらに５分待つ ③アンタゴニストを投与 ④１分後アゴニストを投与し収縮高を測定する ⑤ ３回洗浄、５分後１回洗浄、さらに５分待つ

Dimethylphenylpiperazinium アゴニスト ACｈ　２×１０－４M、０．２ｍｌ Histamine　 ２×１０－４M、０．２ｍｌ Dimethylphenylpiperazinium 　２×１０－３M、０．２ｍｌ　 →Tyrode液４０ｍｌの入った腸管懸垂槽に投与 　　　　　アゴニスト 　　　最終濃度（M) ACｈ １×１０－６ Histamine Dimethylphenylpiperazinium １×１０－５

アンタゴニスト →Tyrode液４０ｍｌの入った腸管懸垂槽に投与 アンタゴニスト 最終濃度（M) ３×１０－５ １×１０－６ Hexamethonium 　２×１０－３M、０．６ｍｌ Atropine　 ２×１０－４M、０．２ｍｌ Diphenhydramine 　 ２×１０－４M、０．２ｍｌ　 →Tyrode液４０ｍｌの入った腸管懸垂槽に投与 アンタゴニスト 最終濃度（M) Hexamethonium ３×１０－５ Atropine １×１０－６ Diphenhydramine

シンプルな腸管収縮モデル ACｈ His ヒスタミン受容体 ムスカリン性受容体 ニコチン性受容体 His（Histamine)

シンプルな腸管収縮阻害モデル His DPH ACｈ ACｈ Atr C6 His(Histamine) C６ (Hexamethonium) Atr(Atropine) DPH (Diphenhydramine)

t検定(両側)によるcontrolに対する有意差検定 解析 収縮率：平均値±標準偏差 t検定(両側)によるcontrolに対する有意差検定 *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.

ACｈによる腸管収縮と阻害 DPH ACh ACh ACｈ Atr C6 C６ (Hexamethonium) Atr(Atropine) DPH (Diphenhydramine)

AChの収縮率（％） Group ACh C6 Atr DPH 1 100 114 99 2 97 59 3 104 84 4 101 92 99 2 97 59 3 104 84 4 101 92 5 4.7 54.7 6 123 139 7 110.2 70.3 8 108.1 112.1 9 95.2 61.9 10 69.5 57.9 11 62 12 114.8 33.3 13 61.1 31.6 14 98 74.5 15 101.2 82.1 16 104.1 94.6 平均 0.29375 75.5 標準偏差 15.95285 1.175 28.04149 T検定 0.767631 1.464×10-30 0.003258

AChによる腸管収縮と阻害 ＊＊ ＊＊＊ C６ (Hexamethonium) Atr(Atropine) DPH (Diphenhydramine)

Histamineによる腸管収縮と阻害 His DPH His（Histamine) DPH (Diphenhydramine)

Histamineの収縮率（％） Group His C6 Atr DPH 1 100 111 109 37 2 138 3 120 135 3 120 135 70 4 108 5 87.3 107.8 55.9 6 115.3 116.7 52.78 7 15.4 8 108.2 109.7 56 9 136 140 14.7 10 168 134 22 11 101 104 30.3 12 118.2 39 13 16 14 116.2 121 15 174 196 40 95.8 94.8 21.9 平均 110.9375 114.5125 28.43625 標準偏差 34.8309 37.4747 22.85251755 T検定 0.228303 0.142208 2.39931×10-9

Histamineによる腸管収縮と阻害 ＊＊＊ C６ (Hexamethonium) Atr(Atropine) DPH (Diphenhydramine)

Dimethylphenylpiperaziniumによる腸管収縮と阻害 DMPP ACｈ C6 Atr DPH DMPP(Dimethylphenylpiperazinium） C６ (Hexamethonium) Atr(Atropine) DPH (Diphenhydramine)

Dimethylphenylpiperaziniumの収縮率（％） Group C6 Atr DPH 1 60 59 2 36 3 11 65 4 26 53 61 5 62.5 3.8 2.5 6 71.4 15.2 16.2 7 55.1 8 87 4.4 45 9 32.3 29 9.7 10 22.4 16.4 2.3 23.3 30.2 12 1.8 14.3 85.7 13 50 66.7 95.2 14 82.1 103.6 15 43.3 11.1 17.1 16 22.7 20 平均 38.35 28.35 39.1625 標準偏差 26.46429 27.64593 34.91844 　　　　　　　　T検定　　　　　　　　　　　　　　　　　　1.25484×10-7　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　3.10436×10-8　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　4.50699×10-6

Dimethylphenylpiperaziniumによる腸管収縮と阻害 ＊＊＊ ＊＊＊ ＊＊＊ DMPP（ Dimethylphenylpiperazinium ） C６ (Hexamethonium) Atr(Atropine) DPH (Diphenhydramine)

Dimethylphenylpiperaziniumの個々の結果

結果のまとめ

AChの実験結果 AChに対する阻害作用の強さは Atropine＞Diphenhydramineであった。 HexamethoniumにはACｈに対して阻害作用がみられなかった。

Histamineの実験結果 DiphenhydramineはHistamineに対して阻害作用がみられた。 Hexamethonium、 AtropineにはHistamineに対して阻害作用がみられなかった。 DiphenhydramineはHistamineに対して阻害作用がみられた。

Dimethylphenylpiperazinium の実験結果 Hexamethonium、Atropine、DiphenhydramineすべてにおいてDimethylphenylpiperaziniumに対して阻害作用がみられた。しかし、その強弱までは今回の結果からは推測できなかった。 理論では予想しにくい結果がみうけられた

考察 刺激作用 抑制作用 ＜DMPPについて＞ DMPPを大量または長時間投与 初期刺激の後、速やかな伝達遮断がおこる 脱分極性遮断を起こし他の遮断薬に対しても不応状態となる （接合部後膜の電気的回復が阻害されるため） 刺激作用　　　　 抑制作用

ジメチルフェニルピペラジニウム(DMPP)の作用の違い ★作用部位の違いによると考えられる アセチルコリンやヒスタミンが直接、受容体に作用するのに対して、 DMPPは間接的に作用するためと考えられる 　★DMPPを洗浄するまでの時間が班によって異なっていた 学生実習では班によって作用時間が異なってしまったことに より、阻害作用に差異がみられたと考えられる

補足：　腸管の反応自体に差異がみられたのではないか 使用した腸管が最後まで正常に機能していたかを確認して いた班と確認しなかった班があるため 全ての班で腸管の機能が正常かどうかを確認するべきであった