Journal of Investigative Dermatology, 13 June 2013 Prolonged Activation of ERK Contributes to the Photorejuvenation Effect in Photodynamic Therapy in Human Dermal Fibroblasts ERKの持続的活性化は 繊維芽細胞における光線力学的治療法(PDT)の光若返り効果に寄与する 2015.09.28 ゼミ M2　中山千華

PDT(光線力学的治療）とは 生体内の病巣に親和性のある光感受性物質を投与し、可視光線照射によって発生したROS光化学反応を利用した局所的治療法。 正常組織への障害が非常に少ない低侵襲な治療法である。 癌や皮膚疾患、加齢黄班疾患　等に用いられる。 真皮層には600 nm波長の赤色光を用いる ALA(5-Aminolevulinic acid)　→→→　ポルフィリン

ERK5 ？？ ROSはMAPKを活性化する ROSはMAPKを活性化する ERKは細胞成長とか、あとの二つはサイトカンやストレス応答 コラーゲン合成・MMPにも関わる http://www.medogene.com/My%20Researches/Signaling%20pathways/MAPK-Pathway.html ERK5　？？

MMP PDTは光老化の治療に効果的と言われている →だが分子メカニズムは分かっていない ・・・そこを明らかにしたい 本実験では 線維芽細胞を用いて、PDT後の皮膚再生過程における分子メカニズムを明らかにすることを目的とした。

Fig① PDT処理は線維芽細胞の増殖を促進する PDT処理条件の検討(MTT assay) A:　ALA(5-Aminolevulinic acid)による線維芽細胞への毒性は認められなかった B:　これらの条件下において照射量・距離ともに細胞毒性は認められなかった 繊維芽細胞は、増殖からⅠ型コラーゲン等のECMの再構成まで、皮膚再生に大きな役割を果たすことが報告されているが、 この増殖に関してPDTがどのような影響を与えるのか検証した C：　見た目も問題なし　ALA（0.1mM） Photo(3 J) PDT (0.1mM 3 J/cm2) ALA, Photo(633 nm red light), PDTによる細胞毒性は認められなかった

Fig① PDT処理は線維芽細胞の増殖を促進する PDT処理が細胞増殖に与える影響を評価(d: MTT assay, e: PCNA) (ALA 0.1mM, Photo 3 J/cm2) Supplement２　 ALA (up to 0.5 mM) and light (3、１０ J/cm2) ALA 0.1mM, Photo 3 J/cm2の条件が最も高い増殖率を示した D：細胞増殖能を評価　ALA+Photo　のPDT処理のみ、増殖を促進した E：Proliferating cell nuclear antigen (PCNA)は，増殖細胞核抗原とよばれる，DNAを環状化する環状ホモ３量体タンパク質です。酵母からヒトまで高度に保存されており，真核細胞において，PCNAは細胞分裂，DNA複製，修復，細胞周期調節，DNAメチル化やクロマチンリモデリングのような複製後修飾で重要な役割を担っています。 PDT処理のみ、線維芽細胞の増殖を促進した

Supplemental figure1 Figure S1. Increased fibroblast proliferation at the PDT condition. Fibroblasts were treated with ALA alone (0.1 mM), light alone (3 J/cm2), and PDT condition (ALA 0.1 mM and light 3 J/cm2) for indicated time points. Cell morphology and proliferation was taken by photo. Representative images were taken by phase-contrast microscope. All data shown are representative of three independent experiments.

Figure S2. Not much cytotooxicity in different conditions of treatment. (A) Fibroblasts were treated with different concentration of ALA (up to 0.5 mM) and light (3 J/cm2) for indicated time points. Morphological change and cell cytotoxicity were taken by photo. (B) The effect of different light source in fibroblasts. Cells were treated with different light sources (3 and 10 J/cm2) for 12 h and morphological change and cell cytotoxicity were taken by photo. Representative images were taken by phase-contrast microscope. All data shown are representative of three independent experiments.

Fig① PDT処理は線維芽細胞の増殖を促進する 線維芽細胞の運動性を評価(scratch wound assay) ▶皮膚再生に関して、 PDTは細胞増殖・運動性の両方を促進している可能性がある

Fig②PDT処理は、線維芽細胞におけるERKの持続的活性化を誘導する (western blot) PDT処理によって、ERKは素早く活性化し、8時間持続した 一方、Photoのみは初期のみ活性化、ALAのみは活性化せず (30 ng/mL, 30 min) 多くの研究報告により、MAPKシグナル伝達が細胞増殖に重要な役割を果たすことが分かっている。 PDT効果のメカニズムを解明する為にPDT処理下におけるMAPKの活性状態の変化を検証した。 A：PDT処理によってERKは素早く活性化し、その効果は8時間まで持続した。Photoは素早い活性化のみに対して、ALAのみは活性化されなかった B、C：TNF-αにはMAPK三つとも活性化するのに対して、PDTはERKのみ活性化した PDT処理はERKのみ活性化した

Fig②PDT処理は、線維芽細胞におけるERKの持続的活性化を誘導する (免疫組織・蛍光染色) 免疫染色・蛍光染色でも確かめたが、PDTによってERKが活性化し、4時間まで持続することが分かった。 →PDTはMAPKのうちERKのみ、選択的に活性化することが示された ▶PDTはMAPKのうちERKのみ選択的に活性化する

Fig③PDTに誘導されるERKの活性化は線維芽細胞の増殖に寄与する PD98059(ERK阻害剤) 20 µM, 30 min → PDT処理 → 4時間後western blotting ERK阻害剤は、PDT処理によるERKの活性化を阻害した 繊維芽細胞におけるERK活性化の役割をさらに明らかにするために、 PDT処理後、PD98059（ERK阻害剤）が繊維芽細胞の増殖に与える影響を評価した。 ERK阻害剤は、PDT処理によるERKの活性化、PCNA(細胞増殖)を抑制した 　→　PDT処理がERKの活性化・細胞増殖に関与していることが分かった PCNA評価 ERK阻害剤は、PDT処理による PCNAの発現の増加を抑制した

Fig③PDTに誘導されるERKの活性化は線維芽細胞の増殖に寄与する PD98059(ERK阻害剤) 20 µM, 30 min → PDT処理 → 16 時間後 wound healing assay PDT処理によって、増加した細胞運動性は、ERK阻害剤処理によって、阻害された →　PDTによるERKの活性化と、それに続く細胞の増殖・運動性を阻害する PDT処理による運動性の増加は PD98059により阻害された ▶PDT誘導性のERKの持続的活性化に引き起こされる、 線維芽細胞の増殖・運動性促進作用が肌再生の主なメカニズムである

Fig④PDTに誘導されるROSはERKを持続的に活性化し、線維芽細胞の増殖を促進する PDT or H2O2処理後、DCFH-DAを用いてROS産生量を測定・蛍光顕微鏡・共焦点顕微鏡 ERKの活性化は酸化ストレスに対する一般的な応答である。 筆者らは、PDTに誘導されるERKの持続的活化が細胞増殖・遊走性に寄与していることを示したが、PDTに誘導されるROSがMAPKを刺激すると考えられる。 A:低度のPDTによるROSを時間をふって測定したところ、時間が経つにつれてROSの産生は多くなったが、過酸化水素での刺激に比べるととても少ない B： ROSによるERKとかの活性化は起こるが、細胞毒性とか他のMAPKシグナルとかが走らないくらいの低ROS生産量ということ…？ 時間の経過とともにROS産生は増加したが、H2O2刺激に比べると少ない

Fig④PDTに誘導されるROSはERKを持続的に活性化し、線維芽細胞の増殖を促進する NAC(1 mM, 30 min)処理後、PDT処理 → 　c : 4時間後　western blotting 　　　　 d : 24時間後　 PCNA免疫染色 NAC(抗酸化剤)により、PDTに誘導されるERKの活性化・PCNA発現上昇が打ち消された →PDTによるERKの活性化・増殖の促進は、ROSが介していることが分かる NAC(抗酸化剤)により、PDTに誘導されるERKの活性化・PCNA発現上昇が打ち消された

Fig④PDTに誘導されるROSはERKを持続的に活性化し、線維芽細胞の増殖を促進する (BHA：butylated Hydroxyanisole, NAC：N-acetyl-L-cysteine)　ともに抗酸化剤 抗酸化剤によって線維芽細胞の運動性が抑制されることが分かった　→　これもROSを介したもの BHA：butylated Hydroxyanisole　ブチルヒドロキシアニソール NAC：N-acetyl-L-cysteine 　N－アセチルーL－システイン 抗酸化剤添加によって線維芽細胞の運動性が抑制された ▶PDT処理によって産生される細胞内ROSがERKを持続的に活性化させ、 線維芽細胞の増殖を促進する

Fig⑤MMP活性・コラーゲン合成に与えるPDTの影響 a : PCR, b : western blot 光老化と同様、自然老化においても皮膚組織でのMMP発現量・生成量が上昇することが報告されているため、 筆者達はPDT処理がそれらにどのような影響を与えるのか評価した。 MMP-1, 2, 12のmRNA・タンパク質量には影響を与えなかったが、 MMP-3, Collagen type IαのｍRNA・タンパク質量は増加した MMP-1, 2, 12のmRNA・タンパク質量には影響を与えなかったが、 MMP-3, Collagen type IαのmRNA・タンパク質量は増加した

Fig⑤MMP活性・コラーゲン合成に与えるPDTの影響 PD98059(ERK阻害剤) 20 µM, 30 min → PDT処理 → 　e,f : 24時間後 PCR 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 g : 48時間後 western blot MMP-3の増加は、古くダメージを受けたコラーゲン線維の分解と再構築を促進する あるいは、組織内での他の形への再構築 or 繊維芽細胞の遊走に寄与しているのかもしれない。と筆者らは述べている ERKの持続的活性化を誘導するROSの産生を、PDTが誘導することが分かったことから、 PDTは、ERKシグナル経路を介してMMP-3やCollagen type 1αの発現を調節していると考えられる。 ERKの活性化とMMP-3・Ⅰ型コラーゲンコード遺伝子の発現量増加との関係を探るために、 e,f:30minのPD98059処理に続いて、PDT処理を行った →　　ERK阻害剤はMMP-3、Ⅰ型コラーゲンコード遺伝子のmRNA発現を抑制した G:　タンパク質の発現も抑制した ＊ヒト好中球コラゲナーゼ (MMP-8) と, 1次構造はきわめて類似しているがコラーゲン分解能をもたない酵素ストロメライシン (MMP-3) PD98059はMMP-3, Collagen type 1αのmRNA発現を抑制した ---MMP-3, Collagen type 1αの発現は、 ERKの持続的活性化に直接的に促進される ▶PDTはMAPK経路を介して線維芽細胞の細胞機能を活性化する

Fig⑥PDTによる組織学的な変化は紫外線ダメージを受けた皮膚の回復を示唆する 　週2回のPDT治療を4週間受けた後　 　 b : HE染色 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　c : MT染色(Masson's Trichrome Stain) 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　d : EVG染色(Verhoeff-van Gieson Elastic Stain) A 患者は週2回のPDT治療を4週間受けた　→　aged skinと光線角化症、両方において改善がみられた B ：　HE染色　・・・　形成異常のケラチノサイトがなくなった　（？） C　：　マッソントリクローム染色　・・・　真皮上層の、青い部分、コラーゲン線維の増加がみとめられる D:エラスチカワンギーソン染色 (EVG) Verhoeff-van Gieson Stain 利用法：線維と筋肉を区別するだけでなく，弾性線維を同定するのに利用される。弾性線維はHE染色ではほとんど染まらない。 http://www.kuhp.kyoto-u.ac.jp/~pathology/templates/staining/ECMstaining.htmlhttp://www.kuhp.kyoto-u.ac.jp/~pathology/templates/staining/ECMstaining.html コラーゲン量の増加・変性弾性繊維の減少が認められた ▶PDTは臨床応用に効果的な皮膚再生治療法と言える

総括 肌再生 細胞増殖 MMPs⇧ ROS⇧ PDT処理 ERK活性化 ①線維芽細胞の増殖・運動性を促進する ②MAPKのうちERKのみ選択的に活性化する ③ERK持続的活性化を誘導し、それに続く線維芽細胞の増殖・運動性促進作用が皮膚再生における主なメカニズムである ④細胞内ROS産生を促進して、ERKの持続的活性化を誘導し、線維芽細胞の増殖を促進する ⑤臨床的にも効果的な結果を示す 肌再生 ERK活性化 細胞増殖 MMPs⇧ ROS⇧ PDT処理 ▶PDT(光線力学的治療)による肌再生の分子メカニズムが明らかになった