Nox2は高脂肪食によって引き起こされる骨格筋の インスリン抵抗性を制御する。 Nox2 Mediates Skeletal Muscle Insulin Resistance Induced by a High Fat Diet J. Biol. Chem., 22 May ,2015 A. S. P. Figueiredo, A. B. Salmon, F. Bruno, F. Jimenez, H. G. Martinez, G. V. Halade, S. S. Ahuja, R. A. Clark, R. A. DeFronzo, H. E. Abboud, and A. E. Jamali Nox2は高脂肪食によって引き起こされる骨格筋の インスリン抵抗性を制御する。 2015/10/26 M1 眞野　僚

ROSとインスリンシグナルの関係 ミトコンドリア…電子伝達系で産生したスーパーオキシドが、SOD1やSOD2によってH2O2になる。 これが、MAPK等の活性化により、インスリンシグナルを阻害する。インスリン抵抗性によって、ミトコンドリアの機能障害が起こる。 ERストレス…タンパク質のフォールディングの際に、システイン残基の酸化により放出された電子が酸素と結合し、スーパーオキシドへ ERストレスによって、JNKやIKKが活性化して、インスリンシグナルを阻害 Trends in Pharmacological Sciences February 2011, Vol. 32, No. 284

Nox2,4について Nox2はNADPH oxidaseの酵素本体 細胞外 普段はP22phoxとヘテロ二量体を形成しているが、このままでは酵素活性を持たない。 P67phox,P47phox,P40phox,Racからなる複合体が膜移行し、Nox2の複合体と結合することで活性化する。 Nox4は恒常的に活性化している。 骨格筋には、Nox2、Nox4が発現している。 細胞外 細胞質 Basic Res Cardiol (2011) 106:735–747

・ROSの濃度上昇はインスリン抵抗性の発症に関わる(1) ・骨格筋には、ROSの産生に重要なNox2が発現している（2） 背景と目的 ・ROSの濃度上昇はインスリン抵抗性の発症に関わる(1) ・骨格筋には、ROSの産生に重要なNox2が発現している（2） ・筋収縮に必要な筋小胞体からのCa2+放出には、 　Nox2由来のROSが関わる（3） Nox2由来のROSがインスリン抵抗性の進行に関わるかどうかについて検討を行った。 ①これは、フリーラジカルのスカベンジャーを用いた実験や抗酸化酵素の過剰発現の実験⇒インスリン抵抗性の減少 ② (1)Grodsky, G. M.　et al, Endocr. Rev., 2002 (2)Cheng, G., Gene , 2001 (3) Aracena-Parks, P. et al, J. Biol. Chem, 2006

Nox2のノックアウトがマウスの体重に与える影響 １．Wild-type　or Nox2-KOマウス（6週齢）に通常食と高脂肪食を9か月自由摂食 ２．脂肪量と除脂肪量を二重エネルギーX線吸収法で測定した。 Fig 1A　3か月あたりで、高脂肪食では差が見え始めた。 Nox2-KOマウスのほうが、Wild-typeより体重が低くなった。 脂肪量と除脂肪量は、食事、Nox2の有無による違いは見られなった

Nox2のノックアウトがマウスの体重に与える影響 Fig 1Cのグラフを体重に占める割合に換算したもの

Nox2のノックアウトが血糖値、インスリン濃度、 インスリン抵抗性に与える影響 １．Wild-type　or Nox2-KOマウス（6週齢）に通常食と高脂肪食を3か月自由摂食 ２．14時間絶食 ３．血糖値　 　⇒colorimetric assay kitで測定 　　インスリン ⇒ELISAで定量 　　HOMA-IR⇒fasting serum insulin (ng/ml)fasting serum glucose (mM))/22.5 　　　　　　　　　　で算出 HOMA-IRは高い方がインスリン抵抗性 Nox2-KOマウスでは、高脂肪食によるインスリン抵抗性の発症は抑制された。

Nox2のノックアウトがGTT、ITTの結果に与える影響 ITTでは、Nox2-KO SDの方がWT SDより血糖値の減少が早い ⇒GTTにおいて、Nox2-KOの方が値が低い理由 ⇒グラフでは確認できないけど、Nox2-KOの方がインスリン感受性がいい １．Wild-type　or Nox2-KOマウス（6週齢）に通常食と高脂肪食を9か月自由摂食 ２．14時間絶食 ３．GTT⇒1.5 g/kgのグルコースを静脈注射 　　 ITT⇒0.75 IU/kg インスリンを腹腔内注射 4.0,15,30,60,90分後の血糖値を測定

通常食において、Nox2-KOマウスの筋管サイズが小さくなる傾向がある。 高脂肪食が骨格筋の組成に与える影響① 赤：細胞質 青：細胞核 HFDでは、筋肉の周りや間に脂肪細胞の蓄積が見られた １．Wild-type　or Nox2-KOマウス（6週齢）に通常食と高脂肪食を3か月自由摂食 2．腓腹筋のパラフィン切片を作成し、H&E染色で観察 通常食において、Nox2-KOマウスの筋管サイズが小さくなる傾向がある。

高脂肪食が骨格筋の組成に与える影響② 特に違いはなし。 １．Wild-type　or Nox2-KOマウス（6週齢）に通常食と高脂肪食を3か月自由摂食 ２．後ろ足の脂肪量と除脂肪量を二重エネルギーX線吸収法で測定し、3か月間の増加量を計算 筋肉内の脂肪重量　同程度の割合の上昇 最近の研究では、高脂肪食のNox2-KOマウスの内臓脂肪の蓄積が減り、内臓脂肪肥大を弱め、内臓脂肪へのマクロファージの侵入を減らす。 特に違いはなし。

高脂肪食が骨格筋の組成に与える影響③ 特に違いはなし。 濃い青：MHCⅠ 薄い青：MHCⅡa MHC（Myosin Heavy Chain） ⇒ミトコンドリアを多く含み、持続的な収縮が可能 速筋繊維（白筋、MHCⅡからなる） ⇒解糖系による瞬発的な収縮が可能 MHCⅠが多い⇒遅筋繊維（赤筋） ミトコンドリアが多く、酸素を利用した持続的な収縮が可能 遺伝子型でも食事法でも違いはない。 １．Wild-type　or Nox2-KOマウス（6週齢）に通常食と 高脂肪食を3か月自由摂食 ２．腓腹筋の切片をトルイジンブルーで染色し、 Myosin ATPase活性から、筋繊維のタイプを調べた。 特に違いはなし。

高脂肪食が骨格筋の組成に与える影響④ 発現量に関しても特に違いはなし。 １．Wild-type　or Nox2-KOマウス（6週齢）に通常食と高脂肪食を3か月自由摂食 ２．筋肉を単離し、ウエスタンブロット 発現量に関しても特に違いはなし。

高脂肪食がNoxの遺伝子発現に与える影響 Fig.4A 野生型（240bp）、変異型（195bp）のジェノタイピング Fig.4B 左側 １．凍結した腓腹筋（or Raw細胞）から抽出したRNAを逆転写 ２．生成物またはNox4 cDNAを含むプラスミドをRT-PCR 右側 総タンパク質50 µgをウエスタンブロット Nox2の抗体で反応した他のバンドは、GRP58/Erｐ５７との交差 骨格筋にNox2複合体は全て発現していることを確認した。

高脂肪食がNox2,4のmRNAの発現に与える影響 １．Wild-type　or Nox2-KOマウス（6週齢）に通常食か高脂肪食を3、9か月自由摂食 2．骨格筋よりRNAを抽出 3．qRT-PCRにより、mRNA量を測定 Nox2:高脂肪食により、発現が上昇した。 Nox4:9か月の摂取のみ発現が上昇した。

高脂肪食がNox2,4のタンパク質の発現に与える影響 １．Wild-type　or Nox2-KOマウス（6週齢）に通常食と高脂肪食を9か月自由摂食 2．ウエスタンブロットにより、タンパク質発現量を測定 3か月でも同様の結果が得られた。 他の複合タンパク質は変化なし。 おそらくNox4の間違い Nox2とp22phoxのみ高脂肪食により発現が上昇した。

高脂肪食がスーパーオキシド産生に与える影響 1．Wild-type（6週齢）に通常食か高脂肪食を3か月自由摂食 2．腓腹筋を単離し、凍結組織切片を作製 （3．400 units/ml SOD or 10 µM DPIで前培養） 4．300 nM DHEで10分処理 5．共焦点顕微鏡で観察 DHE:ジヒドロエチジウム スーパーオキシドに反応して赤色に呈色 DPI ：ジフェニルイオドニウム フラビン酵素阻害剤（Nox2の阻害） SOD：スーパーオキシドジスムターゼ スーパーオキシドアニオンを酸素と過酸化水素に不均化する酸化還元酵素 ROSのうち、スーパーオキシドアニオンラジカル(O2・-)を比較的特異的に検出できる蛍光プローブとしてジヒドロエチジウム(DHE)が汎用されるようになった。DHEはO2・-と反応しエチジウムカチオン(E+)を生成し、これがさらに細胞内の核酸とキレートすることで赤色の蛍光を発するとされてきた。 これらの反応は、スーパーオキシドジスムターゼ（スーパーオキシドアニオン（・O2-）を酸素と過酸化水素へ不均化する酸化還元酵素）やジフェニレンイオドニウム（NOS阻害物質）によりエフェクトが消える。⇒スーパーオキシドはNox2由来である。 高脂肪食により、スーパーオキシドの産生量が増加した。 また、これがNox2由来であることも分かった。

Nox2のノックアウトがスーパーオキシド産生に与える影響 1．Wild-typeかNox2-KOマウス （6週齢）に通常食か高脂肪食を 3か月自由摂食 2．腓腹筋を単離し、凍結組織切片を作製 3．300 nM DHEで10分処理 4．共焦点顕微鏡で観察 Nox2のノックアウトにより、スーパーオキシド産生量が減少することを確認した。 Nox2のノックアウトにより、スーパーオキシド産生量が増加⇒Nox4などが増えたのでは？（Nox4の活性化は発現量に比例）⇒でもタンパクは増えてない（Fig4D）けど、高脂肪食によって増えてないので関係ない よって、高脂肪食によるインスリン抵抗性にはNox2の酸化ストレスが重要

Nox2のノックアウトがインスリンシグナルに与える影響 1．Wild-typeかNox2-KOマウス（6週齢）に通常食か高脂肪食を9か月自由摂食 2．骨格筋を単離し、膜画分とホモジネートを作製（P-AktとGlut4の測定をするマウスには、屠殺前に15分のインスリン投与） 3．ウエスタンブロット Nox2のノックアウトによりGLUT4の発現量が増加する 高脂肪食により、インスリン刺激によるAktのリン酸化とGLUT4の膜移行は減少した。Nox2のノックアウトでは確認されず Glut4は2型糖尿病の遅筋繊維では減少する。⇒GLUT4の発現量は筋繊維組成の変化に先行する繊維の代謝変化の指標なのでは？ 膜移行の割合 発現量 GLUT4の発現はNox2に 依存している。 PDI：プロテインジスルフィドイソメラーゼ

A:分化前と分化後の写真 B:myogenin（分化マーカー）の発現量をRT-PCRで確認 C2C12筋芽細胞の分化を確認した。

Nox2に関わるタンパク質の発現は、分化後の方が多い。 分化前後のC2C12のNox2に関わるタンパク質のmRNA発現量とタンパク質発現量 Nox2に関わるタンパク質の発現は、分化後の方が多い。

High Glucoseによってインスリン抵抗性を惹起した。 高濃度グルコースがAktのリン酸化、糖取り込みに与える影響 A 1．C2C12を分化 （2．900 units/mlのカタラーゼで処理） 3．5mM or 25mM Glucoseで48時間処理 4．100 nM インスリンで20分刺激 5．細胞を回収し、ウエスタンブロット B 4．4時間血清飢餓 5．100 nM インスリンで45分刺激 6．0.1 µCi/mlの2-deoxy-[14C]glucoseを 5分添加 High Glucoseによってインスリン抵抗性を惹起した。

パルミチン酸によってインスリン抵抗性を惹起した。 高濃度パルミチン酸がAktのリン酸化、糖取り込みに与える影響 A 1．C2C12を分化 （2．900 units/mlのカタラーゼで処理） 3．200 µMのパルミチン酸で48時間処理 4．100 nM インスリンで20分刺激 5．細胞を回収し、ウエスタンブロット B 4．4時間血清飢餓 5．100 nM インスリンで45分刺激 6．0.1 µCi/mlの2-deoxy-[14C]glucoseを 5分添加 パルミチン酸によってインスリン抵抗性を惹起した。

過酸化水素でも同様の傾向を示した。 過酸化水素がAktのリン酸化、糖取り込みに与える影響 A 1．C2C12を分化 （2．900 units/mlのカタラーゼで処理） 3．100 µMの過酸化水素で48時間処理 4．100 nM インスリンで20分刺激 5．細胞を回収し、ウエスタンブロット B 4．4時間血清飢餓 5．100 nM インスリンで45分刺激 6．0.1 µCi/mlの2-deoxy-[14C]glucoseを 5分添加 過酸化水素でも同様の傾向を示した。

・高濃度のグルコース、パルミチン酸によって糖取り込みが 減少した。 ・カタラーゼ処理により、糖取り込みは改善した。 Fig.7のまとめ ・高濃度のグルコース、パルミチン酸によって糖取り込みが 　減少した。 ・カタラーゼ処理により、糖取り込みは改善した。 ⇒高濃度のグルコース、パルミチン酸の処理で誘導される 　 インスリン抵抗性はH2O2を介して起こる。 H2O2 HG Palm インスリンシグナル

shRNAを導入したC2C12筋芽細胞でも分化を確認した。 MHCとmyogeninの発現をRT-PCRで確認 shRNAを導入したC2C12筋芽細胞でも分化を確認した。 筋管細胞にもともと発現するNox2によって産生するスーパーオキシドの不均化を通じて、H2O2が産生される⇒ノックダウンもしてみた ちょっと増殖能は落ちたけど、分化能は残っている。 Nox2は増殖と分化には必要である。（先行論文より）

shRNAを導入しても結果はFig.7と同じである。 Nox2のノックダウンがAktのリン酸化、糖取り込みに与える影響① プロトコルはFig.7と同様 Nox2、Nox4の発現量は大きな変化はない⇒In vivoとは期間が違うから shRNAを導入しても結果はFig.7と同じである。

shRNAを導入しても結果はFig.7と同じである。 Nox2のノックダウンがAktのリン酸化、糖取り込みに与える影響② プロトコルはFig.7と同様 shRNAを導入しても結果はFig.7と同じである。

Nox2をノックダウンしても過酸化水素が誘導するインスリン抵抗性を阻害しなかった。 Nox2のノックダウンがAktのリン酸化、糖取り込みに与える影響③ プロトコルはFig.7と同様 H2O2はNox2を経由して細胞内に流入する、or酸化還元のシグナルにH2O2自身が関わる Nox2をノックダウンしても過酸化水素が誘導するインスリン抵抗性を阻害しなかった。

・高濃度のグルコース、パルミチン酸によって誘発する インスリン抵抗性には、Nox2が必要である。 Fig.8のまとめ ・高濃度のグルコース、パルミチン酸によって誘発する 　インスリン抵抗性には、Nox2が必要である。 ・Nox2由来の過酸化水素の産生が、インスリン抵抗性の 　発症に必要である。 H2O2 HG Palm インスリンシグナル Nox2

・今回の実験で、Nox2が高脂肪食によるインスリン抵抗性 の発症に重要である。 まとめ ・今回の実験で、Nox2が高脂肪食によるインスリン抵抗性 　の発症に重要である。 ・Nox2をノックダウン・ノックアウトによりインスリン感受性が 　回復した。 ⇒Ⅱ型糖尿病治療の新しいターゲットとして有用であるかも 　　しれない。 ・Nox2が脂質代謝や酸化ストレスに与える影響を研究していきたい。（Fig3Bの結果より） ・インスリン刺激によるカルシウムイオンの放出にも関わる二面性を持つ。（閾値に達するかどうか） ・高グルコース、高脂肪酸によりPKCの活性化⇒インスリン抵抗性

Supplement fig.1 Supplemental figure 1: Validation of enriched plasma membrane preparation: Total lysates obtained from gastrocnemius muscle of wild-type mice fed a standard diet that did not receive insulin injection before sacrifice, were used to isolate an enriched plasma membrane fraction. 20µg of protein of the total lysate (lane 1), supernatant (lane 2), and pellet containing the enriched plasma membrane (lane 3) fractions collected during the procedure were used in an immunoblot experiment to detect Pan cadherin, Lamp1, caveolin, Glut4 and GAPDH proteins. The figure shows the data obtained in a representative immunoblot (A) and PVDF membrane stained with red ponceau (B).