関節リウマチ関連遺伝子 PADI4 と シトルリン・抗シトルリン化ペプチド抗体 ～最近の話題～ 平成18年3月23日 東京女子医科大学附属 膠原病リウマチ痛風センター 京都大学大学院医学研究科附属ゲノム医学センター 理化学研究所遺伝子多型研究センター 関節リウマチ関連遺伝子研究チーム 山田　亮

項目 シトルリン・PADI・抗シトルリン化ペプチド抗体に関する基礎事項 遺伝子 PADI・シトルリン・シトルリン化 アレル差解析(関連解析) PADI・シトルリン・シトルリン化 発現解析 酵素特性解析 基質解析 シトルリン化タンパク質解析 PADI・シトルリン化タンパクの病理 関節リウマチ その他の疾患 動物モデル

？

？ 遺伝子アレル差解析

？ 発現解析

？ 酵素特性解析

？ 基質解析

？ シトルリン化タンパク質解析

？ シトルリン化タンパク質と 自己免疫反応関係の解析

？ 抗シトルリン化ペプチド抗体解析

抗シトルリン化ペプチド抗体と関節炎・関節リウマチとの因果関係 ？ 抗シトルリン化ペプチド抗体と関節炎・関節リウマチとの因果関係

？ 動物モデル解析

項目 シトルリン・PADI・抗シトルリン化ペプチド抗体に関する基礎事項オーバービュー 遺伝子 PADI・シトルリン・シトルリン化 アレル差解析(関連解析) PADI・シトルリン・シトルリン化 発現解析 酵素特性解析 基質解析 シトルリン化タンパク質解析 PADI・シトルリン化タンパクの病理 関節リウマチ その他の疾患 動物モデルの視点からのサマリー

フリーアミノ酸としての出納と代謝 アルギニン シトルリン

NOS、NO産生 アミノ酸代謝 尿素サイクル

コーディングアミノ酸　：　20種 必須アミノ酸　：　 ヒト9種 （＋準必須アミノ酸 3 種(Arg,His,Tyr)) ラット10種(ヒト＋アルギニン) シトルリン 対応tRNAなし 非コーディングアミノ酸

ペプチジルシトルリン化とその代謝サイクル 遊離アミノ酸 抗原提示 ペプチド化 分解と抗原処理 ？ ？ シトルリン化タンパク PADI基質 ペプチジルシトルリン化

アミノ酸の翻訳後修飾としてのシトルリン化 リン酸化 メチル化 水酸化 アセチル化 カルボキシル化 シトルリン化 グリコシル化 分子内反応関連 周辺残基影響 残基特異性

翻訳後修飾間相互作用 メチル化・アセチル化・シトルリン化 翻訳後修飾間関連 メチル化・シトルリン化相互作用 メチル メチル メチル

項目 シトルリン・PADI・抗シトルリン化ペプチド抗体に関する基礎事項オーバービュー 遺伝子 PADI・シトルリン・シトルリン化 アレル差解析(関連解析) PADI・シトルリン・シトルリン化 発現解析 酵素特性解析 基質解析 シトルリン化タンパク質解析 PADI・シトルリン化タンパクの病理 関節リウマチ その他の疾患 動物モデルの視点からのサマリー

？ 遺伝子アレル差解析

Korean

PADI4 gene structure and association-positive SNPs EXONs 1 2 3 6 4 7 5 8 10 9 11 12 13 16 14 15 SNPs exons SNPs Caucasians Japanese

* K562細胞におけるmRNA安定性解析 0h 2h 4h Vector : pcDNA-DEST40 実験方法 CMV promoter PADI4 (susceptible and non susceptible type cDNA) 5’UTR 25bp 3’ UTR 218bp 実験方法 K562細胞にTransfectionし、48時間培養後、 5ug/ml actinomycin D処理 し、RNAを回収、TaqMan assayによりPADI4 RNA量を測定する。18S rRNA (細胞数), Neomycin遺伝子(transfection効率）を用いて補正を行った。 S: susceptible type N: non-susceptible type 100 * Ratio of gradiation (%) 50 * p<0.05 (t-test) S N S N S N 0h 2h 4h

PADI4におけるRA関連ハプロタイプと非関連ハプロタイプ のアレル別発現量比較 Standard curve サンプルＤＮＡ, cDNA: PADI4遺伝子上padi4_89 (A/G)をヘテロ接合体でもつ健常人４人の末梢血リンパ球から精製したgenomic DNAとRNA Probe: Padi4_89 (A/G) genotyping用TaqMan probe Ratio of G: A alleles Ave. genomic DNA: 0.99 Ave. cDNA (4samples): 1.26 ＲＡ関連ハプロタイプは非関連ハプロタイプと比較して、ゲノムの場合は１なのに対して、cDNAでは平均１．３となっている。

PADI4多型とRA発病リスクは 発病リスク多型は アレル差解析 まとめ アジアン＞コーカシアン アレル差解析　まとめ PADI4多型とRA発病リスクは アジアン＞コーカシアン 発病リスク多型は コーディングSNPｓ / イントロンSNPs

項目 シトルリン・PADI・抗シトルリン化ペプチド抗体に関する基礎事項オーバービュー 遺伝子 PADI・シトルリン・シトルリン化 アレル差解析(関連解析) PADI・シトルリン・シトルリン化 発現解析 酵素特性解析 基質解析 シトルリン化タンパク質解析 PADI・シトルリン化タンパクの病理 関節リウマチ その他の疾患 動物モデルの視点からのサマリー

PADI酵素反応 発現・局在レベルの特異性 反応環境による特異性(Ca2+など) 基質特異性 残基特異性 残基修飾状態特異性 発現している臓器・組織・細胞内外・細胞内部位による特異性 反応環境による特異性(Ca2+など) 基質特異性 残基特異性 残基修飾状態特異性

PADIアイソザイム 種間保存 ？生理的役割分担？

PADIアイソザイムの臓器・組織・細胞分布 発現特異性 PADIアイソザイムの臓器・組織・細胞分布

Nakayama HM, Suzuki A, Yamamoto K et al. BBRC 327; 192-200:2005 [Ca 2+]～10-3M 反応環境特異性 [Ca 2+]によるPADI活性制御 細胞外・細胞内核外・核内 [Ca 2+]～10-7M Nakayama HM, Suzuki A, Yamamoto K et al. BBRC 327; 192-200:2005

monocytes and macrophages 発現・活性化調節 monocytes and macrophages Monocyte Macrophage Transcriptional regulation DNA RNA Enzyme DNA RNA Enzyme PADI4 Enzyme-activational regulation Translational regulation PADI2 ER Vossenaar WJ vanVenrooij LAB Joosten et al. Arthritis & Rheum 2004

Nakayama HM, Suzuki A, Yamamoto K et al. BBRC 327; 192-200:2005 基質特異性 Nakayama HM, Suzuki A, Yamamoto K et al. BBRC 327; 192-200:2005

Nakayama HM, Suzuki A, Yamamoto K et al. BBRC 327; 192-200:2005 残基特異性 Nature Structural & Molecular Biology  11, 777 - 783 (2004) Published online: 11 July 2004; | doi:10.1038/nsmb799 Nakayama HM, Suzuki A, Yamamoto K et al. BBRC 327; 192-200:2005

残基修飾状態特異性 モノメチルArg メチル s-ジメチルArg a-ジメチルArg メチル メチル メチル メチル メチル メチル メチル

？PADIの生理機能？ 両方向性反応・逆方向酵素ペア 修飾のON・OFF機能 リン酸化 キナーゼ⇔フォスファターゼ 翻訳後修飾 リン酸化、グリコシル化、アセチル化、ヒドロキル化、シトルリン化 両方向性反応・逆方向酵素ペア 修飾のON・OFF機能 リン酸化 キナーゼ⇔フォスファターゼ アセチル化 アセチラーゼ⇔デアセチラーゼ メチル化 PRMT⇔？デイミナーゼ？

ヒストンのメチル化・シトルリン化の場合 Arg と メチルArg はシトルリン化される ジメチルArg はシトルリン化されない 翻訳後修飾間関連 メチル化・シトルリン化相互作用 メチル メチル メチル 少なくとも単純なON-OFF機構ではない ？シトルリン→アルギニン酵素の存在の有無？

シトルリン化ヒストンのサルベージ(仮説)

Sm (Small nuclear ribonucleoproteins) メチル化とシトルリン化が知られる基質 Histone Sm　(Small nuclear ribonucleoproteins) Autoantigen

その他基質 Fibrinogenと重合性 ATIIIとその活性 Myelin Basic Protein(MBP)と脱髄 Chang X, Yamada R, Yamamot K et al. Rheumatology 44:238-9;2005 ATIII was inactivated by citrullination and citrullinated fraction of ATIII was higher in RA plasma. Fibrinogen citrullination inhibits thrombin-catalyzed fibrin polymerization. Nakayama HM, Suzuki A, Yamamoto K et al.

MBPシトルリン化、シトルリン化残基特性についても知見あり(1970年代より2005年まで)

遊離アミノ酸・ペプチド・PADI酵素の細胞・細胞内器官別分布の解析 抗原提示細胞による処理を経て自己免疫反応成立の可能性？ 生理的処理 アポトーシスを含めて？

存在・局在確認のためのシトルリン・PADIの解析抗体など RA３抗体はRA患者のB細胞を取ってきて、ｓｃFv（抗体の可変領域）をファージベクターに組み込みます。ファージの表面に発現したｓｃFvは抗体の種類だけ存在していることになり、RA患者由来のライブラリでは自己抗体もクローニングされます。ただし、その抗体の抗原が特定のタンパクのみを認識しているかどうかは不明であり、そのほかの様々なタンパクとクロスリアクションしている可能性が実験的にも示唆されています。

PADI4反応産物

項目 シトルリン・PADI・抗シトルリン化ペプチド抗体に関する基礎事項オーバービュー 遺伝子 PADI・シトルリン・シトルリン化 アレル差解析(関連解析) PADI・シトルリン・シトルリン化 発現解析 酵素特性解析 基質解析 シトルリン化タンパク質解析 PADI・シトルリン化タンパクの病理 関節リウマチ その他の疾患 動物モデルの視点からのサマリー

非RA（OA・Reactive arthritis)での 抗CCP抗体の局所産生 RA滑膜シトルリン化蛋白の存在 抗CCP抗体の特異性 破壊性亜型との関連 抗CCP抗体の発病前出現 ~9年 発病予測性 非RA（OA・Reactive arthritis)での シトルリン化蛋白の存在 抗CCP抗体産生B細胞の局所存在

HLA・TCR と シトルリン化ペプチドの関係

Augmentation of T-cell response by citrullinated peptides J.Hill E Cairns et al. J Immunol 2003

Shared epitope 塩基性アミノ酸による ペプチド認識フロア形成

HLA-SE aCCP(+) ? Multi-hit model CCP(+)-RA CCP(-)-RA

シトルリン化エピトープ探索

3. What are Substrates of PADI4 and Epitopes of anti-CCP Ab? Immunoscreening of citrullinated epitopes of RA autoantibodies Yamanaka OM, Suzuki A, Yamamoto K et al. 2005 Okazaki Y, Suzuki A, Yamamoto K et al. BBRC 341;94-100 (2006) Identification of citrullinated eukaryotic translation initiation factor 4G1 as novel autoantigen in rheumatoid arthritis Anti-citrullinated collagen type I antibody is a target of autoimmunity in rheumatoid arthritis Suzuki A, Yamada R, Yamamoto K et al. BBRC 341;94-100 (2006)

シトルリン化自己抗原 シトルリン化寛容抗原 cit’d Fib cit'd Fib cit’d Fillagrin anti-Sa　 anti-perinuclear　 cit'ed CI　 cit'ed CII　 Eukaryotic elongation Factor　 cit’d alpha Enolase　 cit'd Fib　 cit'd Fillagrin anti-Sa　？ anti-perinuclear　？ cit'ed CI　？ cit'ed CII　？ Eukaryotic elongation Factor　？ cit’d alpha Enolase　？ Hisrone ？ Sm ？ MBP ？

項目 シトルリン・PADI・抗シトルリン化ペプチド抗体に関する基礎事項オーバービュー 遺伝子 PADI・シトルリン・シトルリン化 アレル差解析(関連解析) PADI・シトルリン・シトルリン化 発現解析 酵素特性解析 基質解析 シトルリン化タンパク質解析 PADI・シトルリン化タンパクの病理 関節リウマチ その他の疾患 動物モデルの視点からのサマリー

Streptococcal cell wall-inducedで シトルリン化蛋白 CIAでシトルリン化蛋白 細胞核内・核外 ～PADI2・4分布と相関？ シトルリン化Fibrin その他 抗シトルリン化ペプチド抗体が 産生されがたい・・・？ シトルリン化抗原による感作増強？ CIAラット

SNP Research Center, RIKEN, Yokohama, Japan Lab. for Rheumatic DIseases Kazuhiko Yamamoto Akari Suzuki Yuta Kochi Mikako Mori Kyoko Kobayashi Miyako Yamanaka Emi Kanno Keiko Myouzen Akihiro Sekine Tatsuhiko Tsunoda Yusuke Nakamura Clinical Institutes of Collaboration University of Tokyo Hospitals Tetsuji Sawada National Sagamihara Hospital Shigeto Tohma Toshihiro Matsui Center for Genomic Medicine, Kyoto University, Kyoto, Japan Fumihiko Matsuda Shohei Chida Alexandre Vasilescu Hitomi Hiratani Sachiko Toyoda Justine Yovo-Vasilescu Chanavee Ratanajaraya Miki Kokubo Kenei Ohigashi Victor Renault Masao Yamaguchi Katsura Hirosawa