生物科学科(高分子機能学) 生体高分子解析学講座（第3） スタッフ 教授 新田勝利 助教授 出村誠 助手 相沢智康 http://altair.sci.hokudai.ac.jp/ 生物科学科(高分子機能学) 生体高分子解析学講座（第3） スタッフ 教授　新田勝利 助教授　出村誠 助手　相沢智康

タンパク質工学：キーワード タンパク質工学の利用分野 タンパク質工学とは ゲノム・遺伝子・タンパク質 DNA分子の塩基配列とアミノ酸配列 　学術、工学、農学、医薬 タンパク質工学とは 　遺伝子組換え技術、遺伝子化学合成技術、新しいタンパク質の人工合成 ゲノム・遺伝子・タンパク質 　ゲノム遺伝子>遺伝子 DNA分子の塩基配列とアミノ酸配列 　コドン、アミノ酸の一次配列 タンパク質分子とアミノ酸配列 　ペプチド結合、ヘリックス、シート 立体構造解析と NMR 　ノーベル化学賞 K.Wüthrich

タンパク質工学の利用分野　 学術 工学 農学 医・薬

Protein Engineering タンパク質工学の利用分野 学術：タンパク質の立体構造、生物進化 工学：安定化酵素、ナノテクノロジー 農学：遺伝子組換え作物、クローン家畜 医・薬：病気の治療、遺伝子診断(遺伝病)

Journal Protein Engineering この学術雑誌は、タンパク質の機能を理解するために重要な構造と生化学的知見の最新研究を紹介する専門誌

タンパク質工学とは？ 　遺伝子組換え技術 　遺伝子化学合成技術 　新しいタンパク質の人工合成

◎タンパク質工学とは？ 遺伝子組換え技術と遺伝子化学合成技術を使い、設計した新しいタンパク質を人工的に合成すること。 課題：転写、翻訳は生物の力を借りるしかない

タンパク質工学に重要な２つの技術

ゲノム・遺伝子・タンパク質　 ゲノム遺伝子　>　遺伝子

ゲノム・遺伝子・タンパク質 ●遺伝情報（ゲノム）の伝達 ヒト細胞1個あたり 染色体数 46 (22+X)+(22+Y) ●遺伝情報（ゲノム）の伝達　 　　　　　ヒト細胞1個あたり 　　染色体数　46 (22+X)+(22+Y) 　　遺伝子数　約10万(105) 　　塩基対数　30億 (3 x 109) 全長約1m 　大腸菌ゲノム 　　塩基対(4 x 106) 全長約1.4mm ●遺伝情報（遺伝子）の発現 　ヒト 　　発生・分化→約60兆個(6 x 1013) 　　セントラルドグマ 　　　(DNA→RNA→タンパク質) 　　ゲノムの5％だけタンパク質として発現 　　発現時間（一生）：7x105 hr 　大腸菌 　　ゲノムの90％がタンパク質として発現 　　　　　　発現時間（一生） ：0.3〜0.7 hr

DNA分子の塩基配列とアミノ酸配列 　コドン 　アミノ酸の一次配列

DNAの構造 遺伝情報は塩基(Base)配列として記録されている A:アデニン C:シトシン G:グアニン T:チミン ３つの塩基配列で１つのアミノ酸を表す（コドン）

DNA二重らせんは A＝T、G ≡ Cの塩基対 でのみ水素結合できる

DNAコドンとアミノ酸 1st 2nd 3rd 5'-end U C A G 3'end Phe Ser Tyr Cys Leu Stop Trp Pro His Arg Gln Ile Thr Asn Lys Met Val Ala Asp Gly Glu

アミノ酸の表記；3文字、1文字

タンパク質分子とアミノ酸配列 アミノ酸の結合：ペプチド結合 アミノ酸残基の配列：一次構造 局所的な規則構造：二次構造 　　　　　　　ヘリックス、シートなど

タンパク質は折り畳まれて二次構造・立体構造ができあがる ペプチド結合 ヘリックス シート

タンパク質の一次構造のちがいが立体構造のちがいとなる

立体構造のわずかな違いだけで 機能が異なる場合もある！

立体構造とNMR 原子核の磁気的性質を非破壊で観測できる装置(NMR)を用いて、生体高分子（タンパク質、核酸、糖質など）の立体構造が水溶液に溶けたままの状態で決定できるようになってきた。

MS NMR 生体高分子の構造解析2002 NMRとMS 2002年ノーベル化学賞 Kurt Wuthrich John B. Fenn Koichi Tanaka 1/2 of the prize 1/4 of the prize 1/4 of the prize http://www.nobel.se/chemistry/laureates/2002/index.html

NMR分野のノーベル賞 1952 1952 1991 2002 http://www.nobel.se/ Felix Bloch (1905 - 1983) Stanford University USA Edward Mills Purcell (1912 - 1997) Harvard University USA Kurt Wuthrich (1938 - ) ETH, Switzerland Scripps Research Inst., USA Richard R. Ernst (1933 - ) ETH, Switzerland 化学賞(1991) for his contributions to the development of the methodology of high resolution nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. 化学賞(2002) for his development of NMR spectroscopy for determining the three-dimensional structure of biological macromolecules in solution 　　　　　　物理学賞(1952) for their development of new methods for nuclear magnetic precision measurements and discoveries in connection therewith.

核磁気共鳴 Nuclear Magnetic Resonance NMR 1H, 13C, 15N, 31P 原子核の磁気モーメントを超電導磁石の安定磁場中で観測 　　↓ 原子核の距離、化学結合の角度、分子運動などが解析できる。∴立体構造解析可能

NMR用超電動磁石のしくみ タンパク質試料 溶液量30~300 μl 濃度0.3~3 mM

磁場強度いろいろ 1 Tesla=10000 Gauss 実用化 研究中 4 x 10-1 T 850 T 3 x 10-1 T 60 T Sun 33 T 10-4 T 2 ~ (25) T 3 x 10-5 T NMR 3 x 10-10 T 2 T MRI

NMR装置の発展 MHzからGHzヘ 1H共鳴周波数(MHz) 32 CW型 60 90 100 FT型 200 270 300 350 400 600 750 800 900 1000 1046 磁場強度(Tesla) 0.8 常電導 (1957) 1.4 2.1 2.3 4.7 超電導 6.3 7.0 8.2 11.7 14.1 17.6 18.8 (1998) 21.1 (2001) 23.4 24.6 (1997*) * T.A. Cross et al., J. Magn. Reson., 125, 212 (1997). 21.1 T 21.6 T (2002)

原子核固有のNMR周波数 磁場強度： 9.4テスラ 1H共鳴周波数=400MHz 磁場強度：18.8テスラ 1H共鳴周波数=800MHz 化学シフト（微細構造による共鳴周波数の変化） 1H:0〜10 ppm, 13C:0〜20 ppm, 31P:0〜600 ppm

NMRデータから立体構造情報の収集 化学結合による1H-1H相互作用の測定(COSY) →アミノ酸残基の同定、化学結合の回転角度情報の収集 空間の近距離1H-1H相互作用(<5Å)の測定(NOESY) →アミノ酸残基の連鎖帰属、原子間距離情報の収集 NOESY

NMRでわかる距離・角度情報 アミノ酸の一次配列から立体構造を決定するために、NMRからわかる原子間距離、結合の回転角度が利用可能

すべてのNMR距離・角度情報を満たす構造 = 立体構造 (K. Wüthrich et al., ) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(1), 145-150 (2000). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(15), 8334-8339 (2000).

ま と め タンパク質工学の利用分野 タンパク質工学とは ゲノム・遺伝子・タンパク質 DNA分子の塩基配列とアミノ酸配列 　学術、工学、農学、医薬 タンパク質工学とは 　遺伝子組換え技術、遺伝子化学合成技術、新しいタンパク質の人工合成 ゲノム・遺伝子・タンパク質 　ゲノム遺伝子>遺伝子 DNA分子の塩基配列とアミノ酸配列 　コドン、アミノ酸の一次配列 タンパク質分子とアミノ酸配列 　ペプチド結合、ヘリックス、シート 立体構造解析と NMR 　ノーベル化学賞 K.Wüthrich