発光量絶対値測定 － ホタル－ ルミノールの発表は無し … 発光量絶対値測定 　　　　－ ホタル－　ルミノールの発表は無し … 2006.6.29 秋山研 PD　安東 頼子 　　　　　　　　　 　　●研究の背景と目的 　　　　　　　　　　　 　　　　●発光量絶対値測定　ー ホタル ー 　　　　　　　　　　　　　 　　　　●今後の展開

研究の背景と目的

88±25% (pH 7.6, Photinus pyralis) Seliger & McElroy (1959) ① 発光量子収率 88±25% (pH 7.6, Photinus pyralis) Seliger & McElroy (1959) 発光量子収率 vs pH 1959年 発光量子収率 88% 1961年　ルシフェリンの構造決定と合成 　　 　光学異性体のD体のみが発光に寄与 年 旋光度 合成 D-ルシフェリン： -36.0° 精製 ルシフェリン： -0.6° 精製ルシフェリンはラセミ化が進み D体とL体が約50%ずつになっている (H. H. Seliger, W. D. McElroy, Arch. Biohem. Biophys, 88, 136 (1959)) 発光量子収率･･･1個の基質分子が 　　　　　　　　　　　 1フォトンを放出する確率

② 発光色変化 その1 発光スペクトルがpHによって変化する Seliger & McElroy (1959) 発光スペクトル(北米産ホタル) vs pH 　　　 　 　　 　 Yellow-green emission Red pH7.1 pH5.4 pH6.3 (H. H. Seliger, W. D. McElroy, Arch. Biohem. Biophys, 88, 136 (1959)) 中性付近：560nmピークの非対称形状を持つ黄緑色発光 酸性側 ：616nmピークの非対称形状を持つ赤色発光

酵素の種類によって発光スペクトルのpH依存性が異なる ② 発光色変化　その２ 　 酵素の種類によっても異なる !? pH感受型：ミヤコマドボタル、北米産ホタル 　　　　　　　　　ゲンジボタル、ヘイケボタルなど pH非感受型：イリオモテボタル、ヒカリコメツキ 　　　　　　　　　　　など (近江谷克裕 (2004) 生化学, 第76巻, 第1号, p.5-15) 酵素の種類によって発光スペクトルのpH依存性が異なる

研究の現状 ① 発光量子収率 高効率の発光反応機構の解明 ex) CIEEL機構 etc… ② 発光色変化 　　高効率の発光反応機構の解明 　　ex) CIEEL機構 etc… ②　発光色変化 ルシフェリンやその誘導体を用いた生物・化学発光、吸収・蛍光測定 色々な種類の酵素やその遺伝子組換え体を用いた生物発光測定 酵素やその生成物との複合体のX線構造解析 ex) モノアニオン・ジアニオン説、 結合回転説、 ケトン共鳴状態説、 　　　　　 オキシルシフェリン 電荷偏り説、 酵素の構造差異説 考え方の基本は、2つの発光成分の平衡状態によって 発光スペクトルが変化するというもの → 未だに決着していない．．． 絶対値発光計測は不可欠 !

発光量絶対値測定　ー ホタル ー

ホタルの絶対値発光スペクトルと発光量子収率 - 絶対値発光スペクトル - - 発光量子収率 - （1個の基質分子が1フォトンを放出する確率） Luminescence yield (photon/eV) Quantum yield : 41.0 ± 7.4 % (pH 8.5)　 Firefly luciferase : Natural “Photinus pyralis” 　　　　　　　　　　　　 （ＳＩＧＭＡ）

結果の考察 その1 発光量子収率 88%だと思っている人達に この値を信じてもらうには…… 41.0±7.4% (pH8.5) 結果の考察　その1 発光量子収率 　41.0±7.4% (pH8.5)　 88%のおよそ半分の値 → そもそも比較出来ない 発光生物と比較→最も高い値(ウミホタル：28%, オワンクラゲ：17%, 発光バクテリア：12-17%) 一重項状態統計重率の25%を超えている 88%だと思っている人達に この値を信じてもらうには…… ① ルミノールの発光量子収率測定 を行なう !　　　 　　 → 過去の報告(1.2%)と一致 ② Seligerらと同じ方法で ルシフェラーゼ(酵素)を精製する ! 市販のルシフェラーゼ(SIGMA) 発光量子収率測定に使用 → 精製したルシフェラーゼと市販の 　　ルシフェラーゼの発光量が一致

結果の考察 その2 発光色変化 (発光スペクトル pH依存性) 黄緑色発光と赤色発光 本測定で明らかになった事 従来の考え方 黄緑色発光 結果の考察 その2 発光色変化 (発光スペクトル pH依存性) 黄緑色発光と赤色発光 本測定で明らかになった事 従来の考え方 黄緑色発光 (pH7.8 < ) 2.2eV(560nm)、2.0eV(620nm)、1.85eV(670nm) ピークの3つのガウス型発光成分 560nmピークの非対称形状を持つ単一の発光成分 赤色発光 (pH6 > ) 2.0eV、1.85eVピークの2つのガウス型発光成分 620nmピークの非対称形状を持つ単一の発光成分 発光色変化 黄緑色発光成分の中には赤色発光成分が 含まれる。2.2eVピーク成分のpH依存性による。 黄緑色発光成分と赤色発光成分が入れ替わりに観測される。両発光成分の平衡状態pH依存性による。

ΦQY : 発光量子収率, ΦCR : 化学反応効率, 今後の展開 　–発光色変化に関連して- オキシルシフェリンまたは酵素との複合体絶対値 PL測定 　　 ΦQY = ΦCR　×　ΦEX　 × 　ΦLM ΦQY : 発光量子収率, ΦCR : 化学反応効率, ΦEX : 一重項励起状態の効率 　　ΦLM : 励起生成物の蛍光量子収率 オキシルシフェリン PL時間分解測定 黄緑色、赤色発光成分( 2. 2eV 、2.0eV、 1.85eV成分）それぞれの時間測定を行なう 発光成分＋非発光成分 様々な種類のルシフェラーゼを用いた発光量子収率 　 発光スペクトルpH依存性 酵素の種類を変えると発光スペクトルpH依存性が異なる。 その定量的な評価を行なう。

C2-C2’ bondの回転によって発光色が変わる 発光色決定の諸説 モノアニオン・ジアニオン説 発光生成物オキシルシフェリンの励起一重項状態 モノアニオン →　赤色発光　　 　 ↑↓±H+ 　 ジアニオン → 　黄緑色発光 回転角説 C2-C2’ bondの回転によって発光色が変わる MaCapra, F., Gilfoyle, D. J., Young, D. M., Church, N. J., Spencer, P., Bioluminescence and Chemiluminescence, John Wiley & Sons, p387 (1994). オキシルシフェリンのpolarization説 Luciferaseに取り込まれているオキシルシフェリンの電子状態によって決まる Ugarova, N. N., Brovko, L. Y., Luminescence, 17, 321 (2002). N S O -O ＊ O- Keto-form Red emission enolate-form Yellow-green emission H+ N S O -O ＊ Φ Twisted keton

発光減衰時間