細胞膜受容体-天然物リガンド間架橋に最適化した架橋法の開発 A03-1 （ポスター番号 を記入） 源治 尚久（東北大院理） ① 専門分野・習熟スキル： 天然物化学（NMR、質量分析）、タンパク質工学（無細胞合成系、大腸菌発現系） ② 希望する共同研究相手： 細胞膜受容体の発現系・活性試験が行える方 ③ 共同研究イメージ： 細胞膜受容体に対して、従来の光親和性標識法より高標識効率で架橋する（=シグナルが強い）手法を開発する → 将来的には低分子リガンドの標的タンパク質（特に膜タンパク質）同定法に展開したい 生理活性リガンド（低分子）＋架橋剤の生細胞の細胞膜受容体への結合を評価する 抽出・電気泳動・ 標識分子の検出 etc. 架橋分子 共同研究者担当分 生理活性リガンド 発表者担当分 電気泳動などにより標識されたタンパク質を検出し、架橋効率を評価する I. II. 標識タンパク質の検出 ◎ × ○ 以下レイアウトは自由です I. 背景と目的 細胞が最小単位である生物にとって細胞膜を介した情報伝達は生 命維持活動のなかで最重要活動の一つに位置する。それを担うタン パク質のうち細胞膜にあるものを細胞膜受容体と呼んでいる。細胞 膜受容体はその機能の重要度ゆえに多くの天然物リガンドや薬剤の 標的になっており、また内在性リガンドの解明が重要視されている。 このうち特に内在性リガンドによくみられる特徴として “リガンド／受 容体の結合親和性が低い” という点があげられる（=> 情報伝達物質 は ”ON” のシグナルを伝えた後、速やかに消える必要がある）。 現在、天然物リガンドの標的同定の代表的手法としてビーズテクノ ロジーが広く利用されているが、この手法は非特異的結合由来のタ ンパク質を洗浄によって分離する過程を経るため、天然物リガンド／ 受容体間の結合親和性が低い場合に期待する効果を発揮できないこと が多い。またもう一つの代表的手法として光親和性標識法があるが、シ グナル／ノイズ比が低く、人的操作（特定のタンパク質の過剰発現など） を加えていない生体試料から標的同定に至った例はない。 上田研究室ではリガンド側のデザイン設計を工夫することで、これまで の光親和性標識法の欠点であった非特的結合由来シグナルの大幅な 低下を実現した（= ノイズの低下）。 本研究では、細胞膜受容体が置かれた環境に特化した標識分子を検 討することで、高標識効率な標的細胞膜受容体タンパク質の検出を目 指している（= シグナルの増大）。 II. 計画 細胞外 細胞内 III. 結果&考察 細胞膜受容体を捕捉する系の特徴 リガンドの結合親和性が低い 酸化的条件 脂質が多量にある 上記の条件を満たした架橋剤のデザインと選定 ・リガンドの結合親和性が低い ビーズテクノロジーではなく、光親和性標識法のコンセプト（天然物リガンド-標的タンパク質間をラジカル反応を利用して架橋する）を利用する Now in progress ! 標識効率が低くなると想定されるので、より短時間・高効率を期待してレーザー光を利用する ・酸化的条件 酸化されにくい分子構造、システインを標的にしない ・標的タンパク質近傍に多量の脂質二重膜が存在する 脂質や水溶液構成成分にはなくタンパク質のみに存在する化学構造を標的に架橋する “芳香族アミノ酸側鎖と選択的に架橋” を目指す IV. 今後の展開 代表的な細胞膜受容体の、細胞外領域近辺にあるアミノ酸側鎖の種類別の数。細胞膜外領域には芳香族アミノ酸も多い。 以上の条件を考慮して... Now in progress ! 研究の第一目標： 芳香族性をもつ光感受性ラジカル開始剤のうち、生理学的条件下・脂質二重膜共存下でタンパク質と架橋効率がよいもの設計・選定する