校正自動化トロンボグラムにより測定さ れた全血トロンビン生成 M. Ninivaggi, R. Apitz-Castro, Y. Dargaud, B. de Laat, H.C. Hemker, and T. Lindhout August 2012 www.clinchem.org/cgi/content/article/58/8/1252.full.

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1 校正自動化トロンボグラムにより測定さ れた全血トロンビン生成 M. Ninivaggi, R. Apitz-Castro, Y. Dargaud, B. de Laat, H.C. Hemker, and T. Lindhout August 2012 www.clinchem.org/cgi/content/article/58/8/1252.full © Copyright 2012 by the American Association for Clinical Chemistry

2 © Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry  血管構造、血球、血漿タンパク間のバランスの 取れた相互関係が出血を防ぎ、また一方では血栓 症を引き起こす Hemostasis: no bleeding no thrombosis 序章

3 © Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry 序章（続き）  血球と血漿タンパクは、トロンビン生成 (FVIIIa) に おいて複雑な正と負、両方のフィードバック構造網の 中で相互に影響しあう Ref: Tanaka KA et al. Blood coagulation: hemostasis and thrombin regulation. Anest Analg. 2009;108:1433-46

4 © Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry  トロンビンは多機能性タンパク分解酵素である > ホメオスタシスにおいて重大な役割をはたす：トロンビン が多いほど出血は減少、しかし血栓症は増加：トロンビンが 少ないほど出血は増加、しかし血栓症は減少 > その他にも重要な「非ホメオスタシス」機能をもつ  校正された自動化トロンボグラム (CAT) 分析 > 高血小板、血小板欠乏血漿中の両方で、トロンビン形成を 定量的に評価できる > 正常、高、低凝固状態を それぞれ区別できる 序章（続き） Thrombosis time thrombin Normal Bleeding Ref: Tripodi A. The long-awaited whole-blood thrombin generation test. Clin Chem 2012; 58: xxx-xxx.

5 © Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry II IIa ZGGR-AMC AMC* 2. トロンビン濃度は発生した蛍 光によって算出される 1. トロンビンは次々に蛍光を発する 基質を分割する  CAT 分析 序章（続き）

6 © Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry 疑問  なぜ CAT 分析は、従来の検査である PT や aPTT より も優れているのか？

7 © Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry 序章（続き）  なぜ全血でトロンビン生成 (TG ）分析を行うのか？ > 生理学的に近い > 検査室での操作が少ない（遠心分離の必要がない為、 実験誤差の減少と分析実施に必要な時間の短縮にな る） > 抗凝固剤無しの血液からでも、直接測定の可能性があ る（指からの採血）  CAT 分析を全血で行う上での阻害要因 > 分割された基質の蛍光シグナルは、ヘモグロビンによ り消光される > 赤血球が堆積、凝集、そして形成された血栓を吸着す ることから、異常に高いシグナルを発する

8 © Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry 序章（続き）  全血（ WB ） CAT 分析 TG 分析を全血で行うことにおける問題を解決するために以 下のような調整を行った : - AMC ベースの基質よりも、励起, 発光波長がヘモグロ ビンによる影響を受けにくいことから、ローダミン ベースのトロンビン基質の使用 - 血液の薄い層を作り出す為に、多孔質濾紙を使用す ることで赤血球を吸着することができる

9 © Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry 材料 & 方法 40µl ミネラルオイル 濾紙 と 5µl の サンプル  クエン酸塩入り全血（ WB ）  5µl の活性化血液 (50% WB + 50% 試薬 ) > TG: 0.3mM P 2 Rho, 0.5pM 組織因子 (TF), 16.7mM CaCl 2 > 校正 : 0.3mM P 2 Rho, 100nM 校正物質  40µl のミネラルオイル 濾紙 濾紙 + サンプル 濾紙 + サンプル + ミネラルオイ ル

10 © Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry 結果 Figure 1. 反応プロフィール A) 蛍光出力は WB-CAT システムの活性化 PPP ( 点線 ) と全血 ( 実線 ) 中での TG への反応を示す。 B) P 2 Rho 基質と α2M- トロンビン校正物質間での反応の蛍光出力 ( 破線, n = 3) と標準偏差 ( 実線 ) 。 点 線は校正物質の傾きの一次導関数  No substrate consumption and inner filter effect

11 © Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry 結果（続き） Figure 2. 典型的なトロンボグラム 点線は TG の生データを示し、 破線は生データから α2M- トロンビン活性を差し引いたもの、実 線は TG カーブ（破線の一時導関数）である。 Ref: Wagenvoord R et al. The limits of simulation of the clotting system. J Thromb Haemost 2006;4:1331-8.

12 © Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry 結果（続き） Table 1. 組織因子依存性 組織因子 (TF) 濃度、 ETP, 内因性トロンビン電位、 LT, ラグタイム、 TP, トロンビンピーク ; TTP, ピークに対する時間の機能としてのトロンボグラムパラメーター  内因性経路の影響を含めるために低 TF 濃度で分析を行うことを推奨する  ピーク高の分析内、分析間正確性は WB-CAT 分析 の有効な応用に十分である ( トロ ンビンピークにはそれぞれ 6.5% と 10.7% )

13 © Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry 結果（続き） Figure 3. リン脂質依存性 (A) リン脂質小胞 (PV) の添加有無による全血 (WB) 中の TG (B) ヘマトクリット依存性  WB 中の TG へリン脂質小胞 (PV) を添加する必要はない  プロコアギュラントリン脂質は赤血球からのもの B

14 © Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry 結果（続き） Figure 4. Factor VIII 依存性 全血トロンボグラムパラメーターである ETP (A) 、トロンビンピーク (B) と血友病Ａ患者の血 漿 FVIII 濃度間での相関  WB-CAT 分析は FVIII 濃度に対して高感度であり、トロンビン 生成の最も重要な決定要因の一つである。

15 © Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry 結論  マルチウェルマイクロタイタープレートでの、薄層 血液を用いた全血中 TG を正確に測定する方法を確立 した  疑問 : 濾紙の使用にはいくつかの注意点がある。そ れは何か？  疑問 : 臨床での WB-CAT 応用には、今後更にどのよ うな研究が必要か？

16 © Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry 編集スライド  待ちに待った全血トロンビン生成テスト (TGT) > 生体内での凝血促進、抗凝血バランスを評価するには、 TGT が従来の凝血テスト (PT と APTT) に比べて適してい る > 近年まで TGT は血小板欠乏、または多血小板血漿で行わ れていた >Ninivaggi ら (Clin Chem, 2012) は、全血で行うことの出来 る新しい TGT について発表し、これは生体内で何が起き ているのかまねるには以前の TGT よりも優れている

17 © Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Thank you for participating in this month’s Clinical Chemistry Journal Club. Additional Journal Clubs are available at www.clinchem.org 訳者 加藤久美子 Follow us