BD Biosciences 最新 SPCell analysis 理論と実 際 - 実験 Methods と機器性能とは？ -

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1 BD Biosciences 最新 SPCell analysis 理論と実 際 - 実験 Methods と機器性能とは？ -

2 アジェンダ 造血幹細胞における SPCell Analysis – 今までの研究の流れ がん細胞における SPCell Analysis – いくつかの成果と問題点の抽出 – 今後の展望 条件を満たす機器のスペック – 上記内容からどんな性能が必要？

3 Side Population (SP) マウス造血幹細胞研究における SP から、 がん幹細胞研究における SP へ

4 マウス造血幹細胞における Side Population の発見 Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Goodell MA, Brose K, Paradis G, Conner AS, Mulligan RC. J Exp Med. 1996 Apr 1;183(4):1797-806. A novel method to identify HSCs in mouse bone marrow that depends on dual-wavelength flow cytometric analysis of cells stained with Hoechst 33342 alone.

5 マウス骨髄 SP の表現型を支える遺伝子： Bcrp1/ABCG2 Bcrp1 gene expression is required for normal numbers of side population stem cells in mice, and confers relative protection to mitoxantrone in hematopoietic cells in vivo. Zhou S, Morris JJ, Barnes Y, Lan L, Schuetz JD, Sorrentino BP. PNAS vol. 99, no. 19, 12339-12344, Sep, 2002 Competitive repopulation assay to compare the normal overall stem cell activity in Bcrp1 -/- versus Bcrp1 +/+ mice showed no difference in stem cell activity in the bulk bone marrow population. These results show that Bcrp1 gene expression alone defines the SP stem cell phenotype, and suggested that the physiological function of Bcrp1 expression in HSC is to provide protection from cytotoxic substates.

6 CD34 - KSL SP cells analysis Methods Mice : C57BL/6J Jcl ♂ 10-week-old Sample : 1x10 6 /ml (5x10 5 /ml, 2x10 6 /ml ) Medium : DMEM 2% FBS (Low glucose, High glucose, RPMI, αMEM) SP Positive : Hoechst 5ug/ml (4ug/ml, 6ug/ml, 7ug/ml) SP Negative : Hoechst 5ug/ml + Verapamil 20ug/ml Incubation : 90min, 37 ℃ Antibody : CD34 FITC Sca-1 PE 7AAD Lineage (CD3e, B220, Gr-1, Mac-1, and Ter119) PE-Cy7 c-Kit APC (CD45 APC-Cy7)

7 VantageSE KSL SP cell : Hoechst 5ug/ml KSL SP 0.003-0.03%

8 VantageSE KSL SP cell : Hoechst 5ug/ml + Verapamil 20ug/ml

9 Aria KSL SP cell : Hoechst 5ug/ml KSL SP 0.003-0.03%

10 Aria KSL SP cell : Hoechst 5ug/ml + Verapamil 20ug/ml

11 CD34 - KSL SP cells CD34- population : about 30%

12 FACS を用いたマウス造血幹細胞の解 析からの知見 ・これまでの KSL 細胞と相関が高く、複数のマーカーなしに造血 幹細胞の 濃縮ができる SP の性質は造血幹細胞以外の、他のマーカーの少ない組織幹細胞でも報告されてお り、幹細胞を濃縮できる方法としての応用が期待された → 以降のがん幹細胞解析へと続く ・ BCRP1 ノックアウトの解析により、 SP は造血幹細胞の維持と分 化に必須 ではない SP の薬剤耐性の性質は、長期的な幹細胞としての性質の維持に役立っている可能性 がある （幹となる細胞として、外的な変異要素を受けないようにするのは、固体の長期的な 維持を考えた場合にも、自然な働きと考えられる） ・マウスの造血幹細胞における SP は静止期にある細胞と考えられ る 造血幹細胞が自己複製や分化に移行している段階では、必ずしも SP の表現型を示さ ないことが報告されており、造血幹細胞の状態に応じて、 SP の表現型は変化すると 考えられる

13 がん幹細胞への研究の展開 SW480 cell Vantage SE DiVa UV LaserSORP Aria 355nm laser

14 がんを起こす細胞にも分化段階があ る Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell Dominique Bonnet and John E. Dick Nature Medicine. 1997, 3, 730-737 がんにおける幹細胞の存在はそれまでにも示唆されていたが、 AML において CD34 強 陽性 CD38 陰性の分画に leukemia-initiating cell の存在を NOD/SCID マウスへの移植 実験により示し、今日注目されているががん幹細胞の存在を始めて明確に示した。 Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells Muhammad Al-Hajj, Max S. Wicha, Adalberto Benito-Hernandez, Sean J. Morrison, and Michael F. Clarke PNAS April 1, 2003 vol.100 no.7, 3983-3988 Breast cancer において、 CD44 + CD24 -/low Lineage - の分画が、 NOD/SCID マウス への移植実験により、 CD44+ CD24+ Lineage- と比較し、明らかに腫瘍形成能が高 いことを示した。

15 がん幹細胞における SP 解析 Presistence of a small subpopulation of cancer stem-like cells in C6 glioma cell line Toru Kondo, Takao Setoguchi, and Tetsuya Taga PNAS, January 20, 2004, vol.101, no.3, 781-786 Our findings suggest that the SP may be a general source of cancer stem cells, which need targeted for effective cancer therapy. C6 glioma における SP は、 non- SP と比較し明らかに腫瘍形成 能が高く、また、様々な神経 細胞に分化する多分化能も維 持していることを示し、 SP に よるがん幹細胞解析の可能性 を始めて示した。

16 SORPAria 355nm UV レーザーを用 いた SP 解析 Methods Cells : HeLa, HT-29, SW480 など 細胞の処理には Accutase を使用。細胞は凝集がない状態に単分散させることが重要。 Sample : 1x10 6 /ml Medium : DMEM 2-5% FBS (Low glucose, High glucose) グルコース濃度のよっても SP の割合は変化する（データ参照） SP Positive : Hoechst 5ug/ml (1ug/ml - 10ug/ml and more) がん細胞によって、 Hoechst の排出能には大きく差がある。 SP Negative : Hoechst 5ug/ml + Verapamil 10-30ug/ml or Reserpine 5-15ug/ml Incubation : 60min, 37 ℃ インキュベート中は、染色条件を一定に保つため攪拌することが望ましい。 細胞により適切な SP の染色条件は必要である。

17 SORPAria UV レーザーを用いた HeLa 細 胞の SP 解析.1 SP SortMP Sort VantageSE での HeLa SP

18 SORPAria UV レーザーを用いた HeLa 細 胞の SP 解析.2 Hoechst 1ug/ml – 5ug/ml Hoechst 6ug/ml – 10ug/ml Hoechst 濃度の基準をどこに置くかは、 SP の実験を組み立てる上での重要な 要素となる。 例えば先の C6 glioma の論文では、 2.5ug/ml で 90 分で Hoechst 染色されている が、 染色の濃度や時間、染色中の攪拌などは各研究者で異なっている。

19 SORPAria UV レーザーを用いた HeLa 細 胞の SP 解析.3 HeLa 細胞を 2 種類の培養液で、それぞれ Hoechst 濃度を変えて染色した場合の SP 存在率。 グルコース濃度が変わるだけで、 SP の存在比率は約半分となる。 DMEM high glucose DMEM low glucose

20 SORPAria UV レーザーを用いた HeLa 細 胞の SP 解析.4 例えば 3 種類の表面マーカーを組み合わせることで、 SP と同様の集団を特定することもできた

21 ・がん細胞においても SP を用いることで腫瘍形成能の高い細胞 が 濃縮できる SP により濃縮された細胞により、 1,000 個のオーダーでも腫瘍形成能が認められ ている報告がある。マーカーの少ないがん幹細胞の検索において、 SP は未分化な がん細胞を濃縮するための有効なマーカーとして考えられる。 ・がん細胞においても表面抗原を用いることで腫瘍形成能の高 い細胞を濃縮できる 表面抗原を用いた解析からは 100 個の細胞からも腫瘍形成を認めるとの報告も出て いる。用いられている表面マーカーは、 CD133 など、これまでの組織幹細胞の解 析を応用したものも多い。 ・ SP や表面抗原を組み合わせたマルチパラメーターでの解析が 期待される マウス造血幹細胞での展開は表面抗原から SP であったが、がん細胞においては SP からさらに表面抗原を見出し、同時に解析していくことが期待される。また、マ ウス造血幹細胞における SP の詳細な解析は、がん幹細胞研究における SP の結果を 理解する上でも、非常に重要である。 FACS を用いたがん幹細胞の解析から の知見

22 条件を満たす機器スペックっ て？ 高感度 – フローセルを使用したシステム – 長方形フローセルの採用 マルチカラー対応 – 豊富なレーザー構成 – ハイパワー UV レーザー 操作性 – 従来 Sorter のハンドリングからの脱却 – 安定 Sorting の条件

23 高感度 Rectangle フローセル１ Cuventte flow cell はベンチに組み込れています。 よってレーザーの照射位置は固定されています。 蛍光検出レンズと Cuventte flow cell はゲルで接 着されています、よって蛍光の検出感度が高く 半導体レーザーのような出力の少ないレーザー で測定することが出来ます。 ノズルサイズは 70μ 、 100μ が装着できます、先 端のノズル部（金属＆ダイアモンド）を取り外 すことにより変更することが出来ます。

24 高感度 Rectangle フローセル２ 現行： Vantage システム 上面から見た フローセルの断面 レンズ ゲル 新性能 Rectangle （＝長方形）フローセル＆ゲルの装着

25 高感度 Rectangle フローセル３ Rectangular Quartz Cuventte 長方形 Quartz Cuventte を使用しています。 –sample 流が細く絞りこまれるため、レーザー照射時に細胞が均一に流れるの で C.V 値が小さくなります。 Lase r 他メーカー 上面図 側面図 強い 弱い Laser Power 弱い 強い 弱い Laser Power 弱い Rectangular Cuventte Non Rectangular Cuventte FACSAria

26 FACSVantageSE/Diva における 高速 Sorting による蛍光感度への影響 – マウス ES 細胞 - E-cadherin Alexa488 Flk-1 PE Control 10PSI70PSI35PSI20PSI

27 FACSAria における 高速 Sorting による蛍光感度への影響 – マウス ES 細胞 - E-cadherin Alexa488 Flk-1 PE LO(20PSI)MED(35PSI)HI(70PSI) Control

28 マルチカラー対応システム１ Regular FACSAria SORP FACSAria Blue(488nm)20 mW100 mW Red(633nm)17 mW30 mW Violet(405nm)10 mW50 mW UV(355nm)---20 mW / 60 mW Green(561nm ) ---

29 蛍光色素組み合わせ

30 FACSAria の蛍光補正値の自動 計算 ＊ フォルダと Experiment を作成したら、 Instrument メニュー＞ Instrument Setup ＞ Create Compensation を選択し ます。 蛍光補正に必要な染色試験管の準備とそれ ぞれに専用の Work Sheet が作成されます 。

31 FACSAria の蛍光補正値の自動 計算 ＊ 蛍光補正用試験管を測定したら、 各試験間の positive 領域をクリッ クします。アイコンを使って 1- ク リックで選択できます。 Instrument メニュー＞ Instrument Setup ＞ Calculate Compensation を選択します。 これだけで、測定に使用するすべてのパラメー タ間で蛍光補正値が自動計算されます。 補正値は Experiment レベルの Instrument Level に保存されますので、その後に測定する サンプルには補正されたデータが保存されます 。 微調整のために、測定後に蛍光補正値を変更す ることも可能です。

32 操作性 - 固定式フローセル

33 自動ソーティング設定機能 液滴ﾓﾆﾀﾘﾝｸﾞｼｽﾃﾑ SweetSpot DropDelay 自動計算 AccuDrop 4 方向ｿｰﾃｨﾝｸﾞ QuadraSort

34 自動液滴制御機能 『 Sweet Spot 』 BD FACSAria はフローセルが固定されいます。 よって液滴の形成状態を CCD カメラにてモニ ターして最適の液滴形成状態にフィードバッ クすることが出来ます。 ブレークポイント、液滴の大きさ、液滴と液 滴の間隔、サテライトドロップを画像解析し て 固定の DDF （ﾄﾞﾛｯﾌﾟﾄﾞﾗｲﾌﾞﾌﾘｰｹﾝｼｰ：振動 数） に対して AP （ｱﾝﾌﾟﾘﾁｭｰﾄﾞ：振幅）をフィー ドバックします。

35 DropDelay 自動計算 『 AccuDrop 』機能 蛍光ビースを流して soritng を行い、サ イドストリームにビーズが最も多く 分離される DropDelay 値をコンピューター画面上 で調整します。作業時間は 1 分以内に 終了します。 よって、ノズル交換時、短時間に Soritng を再開することが出来ます。 DropDelay 値の計算行うために、スラ イドにビーズを受けて、蛍光顕微鏡 で数え最適な DropDelay 値を確認する 作業（ 1 時間）は必要ありません。

36 AccuDrop TM 画面 センターアスピレーター サイドストリーム

37 シース圧の安定装置 『 Plenum reservoir TM 』方 式 シースタンク内の圧力変動が少ない設計です 長時間の soritng でも液滴変動が少ない状態を維持しま す

38 高速 Sorting - 液滴形成に関連するパラメー ター‐ ノズルサイズ シース圧 振動数及び振幅（ KHz and Drive ）

39 圧力と液滴形成数

40 Nozzle 選択 50  60  70  80  90  100  130  液滴形成及び収率を高めるためには粒 子（細胞）の大きさによってノズルを 選択する必要があります。 粒子径 <= ノズル径 /6 粒子径 > ノズル径 / ４ thymus spleen - bone marrow adherent cells - larger cells

41 液滴形成数と分取速度

42 現実には！ -VantageSE/Aria- ：マウス ES 細胞 FACSVantageSE/DivaFACSAria

43 まとめ 1 - アプリケーション別必要な機能 - 細胞表面マーカー解 析 –488/633nm レーザー – 表面マーカーと細胞 内抗原などのマルチ カラー解析 – 希少細胞を高速 Sorting がん幹細胞解析 –UV レーザー –SP と表面マーカー解 析 – 細胞毎の条件検討 – 患者検体で実験 BD が提案できる内容 – 標準装備、さらに 2 本追加可能 – 標準で 5 カラー (488nm) 、 2 カ ラー (633nm) –90,000 個 /sec ( 液滴） 、 35,000 個 /sec ( 細胞 ) –355nmUV レーザー –2 ～ 3 種類の細胞で表面マーカー 解析 – 更なる検討必要 – 今後の課題

44 まとめ ２ 蛍光感度の違いを明確にリサーチ – 蛍光の強弱だけでなく、弱陽性に注目 – 表面マーカーと違い、 SP は蛍光強度の違いが ほとんど無い SP と表面マーカーによるマルチカラー解析 – 多重染色のメリットも最大限に！ – デメリットをどう回避する ? いつ、誰が、どんな時でも！ – 全国で Aria 専属オペレーター ０人 – トレーニングは私が !?